ENZIMI DI RESTRIZIONE

(1)

ENZIMI DI RESTRIZIONE

(2)

Reazione

ligasica di

frammenti di

restrizione

(3)

Fig 4.20 separation of poly-A

mRNA

(4)

mRNA Purification

1. Total RNA Purification

2. PolyA⁺ RNA purification using oligo(dT)

(5)

mRNA

primed mRNA

mRNA/cDNA hybrid

AAAAA_n

AAAAA_n TTTTT

Anneal oligo dT primer

Reverse Transcriptase and dNTPs

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 1

(6)

mRNA/cDNA hybrid

nicked RNA

AAAAA_n TTTTT

AAAAA TTTTT RNase H

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 2

AAAAA_n TTTTT DNA Pol I

nicked RNA used as primers by Pol

(7)

2nd strand cDNA in pieces

ds cDNA ^AAAAA_TTTTT

cDNA Library

Clone into vector E. coli DNA

Ligase

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 3

AAAAA TTTTT

(8)

cDNA synthesis

TTTTTTTTT

First strand

Nick translation

cDNA library

(9)

Vettori e clonaggio

Vettori

Plasmidi Fagi

Cosmidi

YAC

(10)

Plasmide

Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente

nella cellula batterica, in grado di replicarsi autonomamente

dal cromosoma.

(11)

VETTORI DI CLONAGGIO

(12)

Replicazione di un plasmide

(13)

INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

(14)

CLONAGGIO:

-TRASFORMAZIONE -SELEZIONE

-CRESCITA COLONIE

(15)

IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA

BATTERICA DI INTERESSE

(16)

(17)

Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear)

Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble) +

galactose

-galactosidase

(18)

Inserting chromosomal DNA into a vector

GAATTC CTTAAG

GAATTC CTTAAG GAATTC

CTTAAG

GAATTC CTTAAG GAATTC

CTTAAG Vector

Chromosome

Cut with EcoRI and add DNA ligase

Recombinant vector

Ampicillin resistant; -galactosidase negative (White on X-Gal)

LacZ gene codes for -galactosidase Ampicillin resistance gene

(19)

Bacteria from ligation plated on ampicillin and X-Gal

Contains wild type plasmd

Contains

recombinant plasmd

(20)

(21)

Lunghezza massima del

DNA clonabile in un plasmide:

circa 20 Kb

(22)

I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi.

Dopo aver infettato una

cellula-ospite utilizzano i suoi sistemi di replicazione e sintesi

delle proteine per riprodursi

(23)

I batteriofagi (o fagi) sono virus

che infettano i batteri.

(24)

Ciclo litico del fago T4

(25)

Il fago più utilizzato in biologia

molecolare è il fago 

(26)

Ciclo litico e

lisogenico

del fago 

(27)

Assemblaggio

di un fago 

(28)

Mappa del genoma del fago 

(29)

Clonaggio di frammenti di DNA nel

fago 

(30)

Formazione di cloni fagici

(31)

L’infezione dei batteri con il fago  è circa 10

³

volte più efficiente

della trasformazione

con un plasmide

(32)

Lunghezza del DNA clonabile in un fago:

20-25 Kb

(33)

Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS

dal fago 

(34)

(35)

Clonaggio di frammenti di DNA in un

cosmide

(36)

Lunghezza del DNA

clonabile in un cosmide:

circa 45 Kb

(37)

EcoR I

Genomic Library

Infect cells

(38)

AAAAAA AAAAAA

AAAAAA

cDNA synthesis

Infect cells

cDNA library

(39)

• Preparing the insert

– Partial digestion preferred

Genomic Library Construction

(40)

Ligation to vector

(41)

Genomic library cDNA library

Genomic DNA mRNA

Source

Species or strains Species or strains Tissues

Developmental stages

Variation

12k -- 20k 0.2k -- 6k

Insert size

Equal Correlate with

expression level

Representation

Only one Expression vs. non

expression

Type

DNA DNA or antibody or

protein

Probe

Gene structure

Infer protein identity

Encoded protein

Infer protein identity

Purpose

(42)

(43)

Screening a eukaryotic gene library

• Homologous gene from other organism

– Mammalian genes are very similar

– Thus if trying to get human gene screen with the equivalent gene from another organism

– Oligonucleotide based on protein sequence or known sequence of homologous gene

– Purify protein and determine sequence

– Build a nucleotide sequence which codes for protein sequence

(44)

Amino acid sequence

Met-Asn-Lys-Trp-Glu-Met

ATG AAT AAA TGG GAA ATG ATG AAT AAA TGG GAG ATG ATG AAT AAG TGG GAA ATG ATG AAT AAG TGG GAG ATG ATG AAC AAA TGG GAA ATG ATG AAC AAA TGG GAG ATG ATG AAC AAG TGG GAA ATG ATG AAC AAG TGG GAG ATG

Met = ATG; Asn = AAT or AAC; Lys = AAA or AAG;

Trp = TGG; Glu = GAA or GAG

How many probes must we make?

(45)

CLONAGGI MULTIPLI

(46)

VETTORI DI ESPRESSIONE

(47)

PROTEINE DI FUSIONE

(48)

PRODUZIONE DI LIBRERIE

(49)

Screening the Library

ATTAGCGCCTTTACGCA

………TAATCGCGGAAATGCGT…………

(50)

Screening with DNA probe

• Probe is identified cloned

– From other organism – Same organism

• Looking for variants

• Chromosome walk

Chromosome walk

(51)

Expression vector

cDNA library

Clone cDNAs

Screen for gene of interest based on activity or antibodies

(52)

Genome Projects

• Whole genome sequencing

• Fragment and clone

• Sequence ALL clones!

• Computer assembles

(53)

Genome Projects

Bee Cat

Chicken Cow

Dog Fruit fly Human

Malaria parasite Microbial Genomes Mosquito

Mouse Nematode Pig

Plant Genomes Central Rat

Retroviruses Sea urchin Tribolium Sheep Zebrafish

• Multiple organisms provide suitable systems for experimentation

– Zebrafish-development – Rat-physiology

– Dog- genetic disease – Fruit fly- behavior

• Some of practical significance

– Mosquito/Malaria parasite

(54)

Il metodo Sanger

(o metodo a terminazione di catena)

1) Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento

Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da

•Elevata processività

•Bassa attività esonucleasica 5’-3’

•Bassa attività esonucleasica 3’-5’

(es. Klenow, Sequenasi)

(55)

ori Ap

BamHI Promotore/operatore

Terminatore Shine-Dalgarno

Evoluzione dei vettori d’espressione

lacI

oriC TAG

M13

Denaturazione del vettore Utilizzo di un fago helper

Per M13 e produzione della Forma a singolo filamento

(1) Produzione dello stampo a filamento singolo

Utilizzo della PCR

Utilizzo di fagemidi

(56)

2) un innesco specifico (primer)

3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con ³⁵S

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica

ha bisogno di:

(57)

5’-A T C T T T T A G A GT A C C

3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

PRIMER DNA Polimerasi

5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A

DNA Polimerasi PRIMER

(2,3) Sintesi del filamento marcato

(58)

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica

2) un innesco specifico (primer)

3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con ³⁵S ha bisogno di:

4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

(59)

La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro

distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi

trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Terminazione della catena

(60)

(61)

ddCTP

5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A

DNA Polimerasi PRIMER

+ ddNTP ( per es. ddCTP)

5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T A^ddC

STOP

Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno in corrispondenza di ogni dCTP

(62)

DNA stampo a singola elica

3’-GGCTAAC

5’ 3’

Ibridazione con Il primer

+

[³⁵S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi

ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP

-CCG ddA -ddC

-C ddC -CC ddG

-CCGATT ddG -CCGA ddT -CCGAT ddT

Sequenza: 5’-CCGATTG A C G T

-CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC

G T

T A GC C

Schema di sequenziamento a terminazione di catena

Direzione di lettura

(63)

Nuovi metodi di sequenziamento

Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica)

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

(64)

Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica)

Vengono effettuate 4 rezioni di PCR, ognuna contiene un solo primer e uno dei 4 dideossi nucleotidi trifosfati. Si generano le consuete famiglie di filamenti a catena terminata che vengono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide

DNA stampo

ddATP PCR con un solo primer

ddA

(65)

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio

e caricare il tutto in solo pozzetto di gel

ddA

ddC ddT

ddG

(66)

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

(67)

Fluorescent DNA Sequencing

A G T A C T G G G A T C

Gel

Electrophoresis

(68)

Detection of Fluorescently Tagged DNA

DNA Fragments Separated by Electrophoresis

Output to Computer

Scanning Laser Excites

Fluorescent Dyes Optical

Detection System

(69)

Fluorescent DNA Sequencing

Data

(70)

Fluorescent DNA Sequence Trace

(71)

Size of gene library

N = ln(1-P) ln (1-A/B)

N = Number of clones

P = 95 % probability of finding gene A = Average size of DNA fragments B = Total size of genome

E. coli has genome of 4,800,000 nucleotides Average size of insert is 10,000 nucleotides Number of clones for 95 % probability is 1700

(72)

Size of gene library

• If genome is large e.g. human genome (3 x 10⁹) then number of clones to make library becomes unrealistic (1058000) if using a

plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA can’t be transformed)

• Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA

– I.e. if each vector contains a large piece of DNA you don’t need so many clones to make a gene library

(73)

What vectors for what libraries?

VectorInsertsizeWhat librariesPlasmid<10 kbBacteriaLambda phage18-25 kbYeastCosmid34-45 kbIntermediateeukaryotesYAC etc0.1 – 1 MbHigher Eukaryotes

Human library requires 14000 YAC clones

Human library requires >1,000,000 plasmid clones

(74)

YAC=yeast artificial chromosome

(75)

Dimostrazione sperimentale degli elementi funzionali di

un cromosoma

(76)

Vettore YAC:

sequenze ARS

CEN

TEL

(77)

(78)

Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC:

fino a 1000 Kb

(79)

Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors

Vector Type Cloned DNA (kb)

Plasmid λ phage Cosmid P1 phage

BAC (bacterial artificial chromosome) YAC (yeast artificial chromosome)

20 25 45 100 300 1000

(80)

Whole Genome Shotgun Whole Genome Shotgun

• Celera Genomics

Fragment and sequence entire genome

Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping

sequence between fragments.

(81)

Overview of Facts Asserted

• 2.91 billion base pairs (bp)

• 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA

• 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s)

• less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

(82)

Structure of the genome

(83)

http://genome.ucsc.edu

(84)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

(85)

(86)

(87)

(88)

(89)

(90)

(91)

(92)

(93)