2. UN NUOVO APPROCCIO ALLO STUDIO DELLA GGT, SCOPO DELLA TESI.

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Un nuovo approccio allo studio della GGT, scopo della tesi

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2. UN NUOVO APPROCCIO ALLO STUDIO

DELLA GGT, SCOPO DELLA TESI.

L’aumento di GGT sierica è solitamente indice di disfunzione epatobiliare ed è un marcatore di abuso di alcool (Whitfield et al., 2001). Allo stato attuale ci sono numerosi dati che attribuiscono alla GGT un ruolo importante anche nel complesso panorama delle malattie cardiovascolari e delle loro complicanze. Recenti studi hanno dimostrato che la GGT sierica, all’interno dell’intervallo di riferimento, è un fattore indipendente prognostico per l’evoluzione dell’aterosclerosi (Wannamethee

et al. 1995, Emdin et al. 2001) e predittivo per lo sviluppo di diabete mellito di tipo

2 (Lee et al. 2003), di sindrome metabolica (Lee et al., 2007) e di patologia cronica renale (Ryu et al., 2007).

Tuttavia la mancanza di specificità dei valori di GGT in relazione a una singola patologia rende impossibile la stratificazione del rischio basata sulla sua attività totale in pazienti con malattie epatiche, sistemiche, metaboliche e cardiovascolari. Inoltre, tale aspecificità complica anche l’interpretazione delle eventuali connessioni patogenetiche tra l’elevazione della GGT e le malattie ad essa correlate.

Esistono tutta una serie di fattori confondenti che interferiscono con l’interpretazione dei valori sierici di GGT. Infatti, l’attività sierica di GGT è influenzata da fattori genetici con un ereditarietà stimabile in 0,52 come ha dimostrato uno studio condotto su gemelli (Whitfield et al., 2002). Inoltre fra i suoi determinanti esistono molti fattori ambientali come fumo, alcool, caffè, attività fisica, farmaci, dieta, inquinamento e, non ultimo, numerose malattie epatiche e

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sistemiche (ad es. diabete mellito tipo 2, obesità). Infine, la GGT è presente nel siero come parte di complessi lipoproteici, con proprietà chimico-fisiche distinte. Tuttavia, la bassa sensibilità e riproducibilità delle procedure adottate fino ad ora per separare e identificare le diverse frazioni di GGT sierica non hanno permesso di elaborare una procedura diagnostica da affiancare alla determinazione del valore totale di GGT.

Recentemente è stato messo a punto un nuovo metodo per la separazione e quantificazione delle frazioni circolanti di GGT nel siero o nel plasma. Tale tecnica prevede l’utilizzo di una cromatografia per esclusione molecolare per separare le frazioni in base al loro peso molecolare (PM) e di una reazione enzimatica post-colonna specifica per la GGT (Franzini et al., 2008). Tale tecnica permette di distinguere nel plasma o nel siero quattro frazioni di GGT (fig 2.1) con un limite di determinazione di 0,5 U/L per ciascuna frazione rispetto alle 5 U/L del metodo standard di laboratorio. Le quattro frazioni identificate sono state chiamate big-GGT (b-GGT, PM 2000 Kda), medium-GGT (m-GGT, PM 940 KDa), small-GGT (s-GGT, PM 140 KDa) e free-GGT (f-GGT PM 70 KDa). I pesi molecolari delle frazioni b-, m- e s-GGT sono compatibili con quelli di complessi con le lipoproteine VLDL, LDL, HDL rispettivamente, mentre quello di f-GGT è indicativo di una forma enzimatica libera. Il PM delle singole frazioni è indipendente dai livelli di GGT associati ad esse, ciò suggerisce un’interazione specifica dell’enzima con le lipoproteine piuttosto che un adsorbimento casuale. Tuttavia, nessuna delle tre frazioni di GGT ad alto peso molecolare ha evidenziato un comportamento esattamente identico a quello delle corrispondenti lipoproteine simili per peso molecolare, ciò suggerisce che queste frazioni non siano un semplice riflesso della

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lipofilia dell’enzima GGT e quindi della sua capacità di adsorbirsi sulle lipoproteine circolanti (Fornaciari, 2007).

Questo nuovo metodo permette un’analisi delle frazioni della GGT riproducibile, sensibile ed in grado di consentire lo studio qualitativo e quantitativo della distribuzione dell’attività enzimatica nel plasma. Lo studio delle frazioni della GGT si prospetta essere di notevole interesse sia per una migliore utilizzazione diagnostica e prognostica di quest’enzima, sia per migliorare la comprensione della patogenesi delle malattie ad esso connesse.

Lo scopo di questa tesi è stato quello di studiare le caratteristiche delle frazioni di GGT, definite in base al nuovo metodo sopra descritto, all’interno di una popolazione di soggetti sani. Per tutte le frazioni sono stati determinati i rispettivi valori di riferimento, la distribuzione rispetto al genere, come esse correlano con tutta una serie di parametri, fra cui alcuni dei già noti fattori di rischio cardiovascolare (ad esempio età, PAS, PAD, TG, livelli di colesterolo LDL, HDL). La stessa analisi è stata effettuata in un gruppo di soggetti con storia di abuso di alcool, situazione che, come è noto, induce un’elevazione dei livelli sierici dell’enzima. Quindi sono stati confrontati i dati ottenuti per le due popolazioni per evidenziare eventuali alterazioni indotte dall’alcool della distribuzione delle quattro frazioni.

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Un nuovo approccio allo studio della GGT, scopo della tesi 44 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 Unità d i fluorescenz a (f.u.) Unità d i fluorescenz a (f. u .) Unità d i fluorescen za (f.u.) Un it à d i flu o resc en za (f.u .)

Volume di eluizione (ml) Volume di eluizione (ml) Volume di eluizione (ml) Volume di eluizione (ml)

B

D

A

C

FIGURA 2.1Cromatogrammi di quattro soggetti sani (2 uomini, 2 donne) A-B) cromatogrammi di 2 uomini con valori di GGT totale rispettivamente di 11 U/L e 30 U/L.

C-D) cromatogrammi di 2 donne con valori di GGT totale rispettivamente di 11 U/L e 30 U/L.