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Capitolo 4
MATERIALI E METODI
La valutazione dell’efficacia antielmintica nei confronti degli strongili gastrointestinali degli ovi-caprini dei composti naturali presi in considerazione è stata effettuata sia attraverso prove in vitro, sia attraverso test in vivo su animali parassitati.
Nelle prove in vitro sono state riprodotte artificialmente le condizioni ottimali per lo sviluppo larvale dalla schiusa delle uova allo stadio infestante L3 degli strongili gastrointestinali dei piccoli ruminanti.
4.1.0 PROVE IN VITRO
4.1.a) Animali
Le uova degli strongili gastrointestinali utilizzate per allestire le copro-culture sono state isolate da campioni fecali di ovini adulti, naturalmente infestati, e prelevati direttamente dall’ampolla rettale degli animali.
Si tratta di ovini meticci di razze da carne allevati con metodo tradizionale in un piccolo allevamento a conduzione familiare per la produzione di carne di agnello che viene consumata direttamente dalla famiglia dell’allevatore. Il gregge è composto da 15 ovini adulti, di cui 2
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maschi e 13 femmine, di diversa età ed in diversi stadi del ciclo produttivo.
L’allevamento è di tipo stanziale e prevede sia il pascolo su terreni aziendali costituiti da prati collinari in cui crescono essenze foraggere polifite, sia un’integrazione in stalla di fieno e cereali, soprattutto nei periodi più sfavorevoli per il pascolamento.
4.1.b) Campioni fecali
I campioni fecali, dopo essere stati prelevati, sono stati conservati a temperatura di refrigerazione ed analizzati entro 24 ore con esame copro-parassitologico quali-quantitativo per valutare la carica parassitaria presente.
Per l’esame qualitativo è stato utilizzato il metodo della flottazione con soluzione satura di cloruro di sodio (NaCl) che presenta un peso specifico di circa 1,2, mentre per l’esame quantitativo è stata utilizzata una tecnica di Mc Master modificata che presenta una sensibilità di 50 uova per grammo di feci (UPG).
Si sono pesati 4 g di feci che sono stati setacciati con un colino e stemperati con 56 ml di soluzione satura di NaCl in una capsula di porcellana; la sospensione ottenuta è stata accuratamente mescolata e poi, con una pipetta Pasteur, si sono riempite le camere del vetrino di Mc Master. Con la sospensione rimanente si è riempito un cilindro da 15 ml fino a formare un menisco convesso alla sommità su cui è stato appoggiato un vetrino copri-oggetto. Dopo circa 7 minuti è stato letto al microscopio il vetrino di Mc Master contando le uova presenti all’interno delle camere in modo da ottenere una stima quantitativa della
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carica parassitaria attraverso il numero di uova presenti in un grammo di feci (UPG). Dopo circa 20 minuti di flottazione il vetrino copri-oggetto posto sulla sospensione è stato posizionato su di un vetrino porta-oggetto ed osservato al microscopio per svelare la presenza delle uova dei parassiti gastrointestinali.
4.1.c) Isolamento delle uova
Per isolare le uova degli strongili dal campione fecale in modo da poterle poi “seminare” nelle culture è stato utilizzato un metodo simile a quello descritto da Taylor (1990) e da Hubert e Kerboeuf (1992) ma modificato in alcuni punti.
Quattro grammi di feci prelevati da campioni fecali con numero minimo di UPG pari a 1000 sono stati posti in un colino da tè dentro una capsula di porcellana e vi sono stati aggiunti 50 ml di acqua distillata.
Le feci sono state mescolate accuratamente fino ad ottenere una sospensione omogenea che poi è stata versata in una provetta da 50 ml e sottoposta a centrifugazione a 2300 r.p.m. per 2 minuti.
Eliminato il surnatante, il sedimento è stato sospeso con la soluzione satura di NaCl in due provette da 15 ml che sono state messe a centrifugare a 1000 r.p.m. per 2 minuti.
Con una pipetta Pasteur si è raccolta la porzione più superficiale del surnatante che è stato posto in due provette da 15 ml in cui poi è stata aggiunta acqua distillata per il lavaggio delle uova dal sale; si è centrifugato ad 800 r.p.m. per 2 minuti, si è eliminato il surnatante e si è aggiunta acqua distillata fino ad ottenere 3 ml di sospensione per ciascuna provetta.
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Da ogni provetta, dopo aver mescolato con molta cura, è stata raccolta una goccia di sospensione pari a 100 μl con una provetta da microtitolo che è stata posta su di un vetrino porta-oggetto ed osservata allo stereoscopio in modo da poter contare il numero di uova presenti.
Conoscendo il numero di uova contenute in 100 μl, è stato possibile calcolare la quantità di sospensione necessaria da inserire in ogni piastra per avere circa 100 uova per ogni cultura.
4.1.d) Copro-colture
Le copro culture sono state allestite in piastre Petri sterili di 6 cm di diametro al cui interno è stato posto il terreno nutritivo e le uova dei nematodi oggetto di studio.
Ogni piastra conteneva circa 3 ml di terreno nutritivo e sospensione di uova ed acqua distillata.
Tali copro-culture sono state poste in camera umida a 23°C ed al riparo dalla luce solare diretta. Con questa tecnica in genere si ottiene la schiusa delle uova entro 48 ore e lo sviluppo delle larve dallo stadio L1 allo stadio L3 dopo ulteriori 5-6 giorni (Hubert e Kerboeuf, 1992).
4.1.e) Composizione del terreno nutritivo
Il terreno nutritivo per ogni piastra è costituito da: • 0,54 ml di soluzione fisiologica sterile,
• 0,06 ml di EBSS (Earle’s balanced salt solution, Sigma, Milano),
• 12 μl di cellule liofilizzate di Escherichia coli (E.coli lyophillized cells of Strain W, Sigma, Milano), sospese in acqua e sterilizzate per un ora a 100°C,
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• 12 μg di Amphotericina B (Amphotericin B from Streptomyces approx 80% HPLC, Sigma, Milano),
• 60 mg di estratto di lievito (Yeast’s extract Molecular biology tested, Sigma Milano).
• 2,4 ml di acqua distillata. 4.1.f) Sostanze utilizzate
QUERCETINA: Roth, Germany; ai dosaggi dello 0,5% e dello 0,75%. ESTRATTO DI ALOE: Estratto commerciale di Aloe arborescens; Aloe Center di Alfonso Bottiglieri; Roma; ai dosaggi dello 0,5%, dello 0,75% e dell’1%.
ALOINA : Aloin, Sigma, Milano; al dosaggio dello 0,5%.
ALOE-EMOIDINA: Aloe-emodin, Sigma, Milano; al dosaggio dello 0,1%.
ACIDO GLICERRETICO: 18β-Glycyrrhetinic acid, Sigma, Milano; al dosaggio dell’1%.
4.1.g) Valutazione dell’attività delle sostanze in esame.
I test utilizzati per la valutazione dell’efficacia antielmintica dei principi sono quelli descritti da vari autori (Coles et al., 1992; Taylor et al., 2002; Pessoa et al., 2002; Alawa et al., 2003; Assis et al., 2003) per la valutazione della antielmintico resistenza.
Per ogni sostanza da testare sono stati eseguiti in vitro tre tipi di test per la valutazione dell’attività antielmintica: uno per la valutazione dell’inibizione della schiusa delle uova (Egg Hatch Test o EHT), uno per la valutazione dell’inibizione dello sviluppo larvale dallo stadio L1-L2
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allo stadio infettante L3 (Larval development Test o LDT) ed uno per la valutazione della capacità di uccidere o paralizzare le larve allo stadio L3 (Larval Motility/Mortality Test o LMT) (Coles et al., 1992; Taylor et al., 2002).
Oltre alle piastre con la sostanza oggetto di studio, ogni test prevede delle piastre di controllo positivo, cioè contenenti solo uova e terreno nutritivo, e piastre di controllo negativo, in cui viene disciolto nel terreno di cultura un farmaco antielmintico di riferimento.
Il farmaco antielmintico di riferimento utilizzato nelle nostre prove è stato il tiabendazolo (2-(4-Thiazoly)Benzimidazole minimum 99%, Sigma, Milano) alla concentrazione dello 0,1%; è stato scelto questo farmaco per la sua efficacia e per la sua spiccata idrosolubilità che ne consente l’uso in un terreno liquido (Taylor et al., 2002).
Per ogni prova, per ciascuna sostanza e per ciascun dosaggio sono state fatte 6 ripetizioni.
La prova in vitro da noi effettuata è stata svolta nel seguente modo, dopo che al giorno 0 sono state preparate tutte le piastre e sono state seminate le uova degli strongili in tutte le culture:
• per quanto riguarda l’EHT, al giorno 0 sono state contate allo stereoscopio tutte le uova presenti in ciascuna piastra dei controlli non trattati e di quelle destinate ad essere trattate sia con le sostanze in esame che con il farmaco di riferimento in tutte 6 le ripetizioni; quindi sono state poste nelle piastre le sostanze da testare. Al giorno 2 sono state ricontrollate tutte le piastre del test di inibizione della schiusa delle uova per valutare il numero di uova schiuse effettivamente contando le larve di primo stadio presenti. Si sono poi confrontati i risultati ottenuti dalle
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piastre trattate con i principi naturali con quelli ottenuti da quelle dei controlli non trattati e trattati con il Tiabendazolo. Al test dell’EHT sono stati valutati: la quercetina ai dosaggi dello 0,75% e dello 0,5%; l’estratto commerciale di aloe ai dosaggi dell’1%, dello 0,75% e dello 0,5%; l’aloina-A al dosaggio dello 0,5%; l’aloe-emoidina al dosaggio dello 0,1% e l’acido glicirretico al dosaggio dell’1%.
• Per quanto riguarda il LDT, al secondo giorno dalla semina sono state contate, con l’aiuto dello stereoscopio, le larve L1 presenti in ciascuna piastra sia dei controlli non trattati, sia di quelle destinate ad essere trattate con i principi naturali in esame e con il Tiabendazolo al dosaggio dello 0,1%; al termine di questa operazione sono state aggiunte le sostanze in tutte le piastre delle 6 ripetizioni di ciascuna prova. Al giorno 7 dopo la semina, cioè 5 giorni dopo il trattamento, sono state ricontrollate le piastre per effettuare il conteggio delle larve al terzo stadio sviluppate all’interno delle piastre ed i risultati ottenuti nelle culture trattate con i principi naturali sono stati confrontati con quelli dei controlli non trattati e dei controlli trattati con il farmaco di riferimento. Con il test dell’inibizione dello sviluppo larvale sono state valutate le seguenti sostanze naturali: la quercetina allo 0,75% ed allo 0,5%; l’estratto commerciale di aloe all’1% ed allo 0,5%; l’aloina-A allo 0,5%; l’aloe-emoidina allo 0.1% e l’acido glicirretico all’1%.
• Per quanto riguarda il LMT, al giorno 7 sono state contate allo stereoscopio le larve L3 vitali presenti in tutte le piastre delle 6 ripetizioni sia dei controlli non trattati sia di quelle destinate ad essere trattate con i principi naturali e con il Tiabendazolo allo 0,1%. Dopo 24 ore dal conteggio e dalla successiva aggiunta delle sostanze da testare nel
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terreno, le piastre sono state ricontrollate per valutare la paralisi delle larve, contando cioè quelle che si presentavano immobili per oltre 6 secondi (Athanasiadou, 2000), comprendendo i risultati ottenuti dalle culture trattate con le sostanze naturali, quelle trattate con il Tiabendazolo e quelle non trattate. Con questo test sono state valutate: la quercetina allo 0,75% ed allo 0,5%, l’estratto commerciale di aloe all’1%, allo 0,75% ed allo 0,5%, l’aloina-A allo 0,5% e l’acido glicirretico all’1%.
4.1.h) Identificazione delle larve
Le larve L3 ricavate dalle copro colture e presenti nelle piastre di Petri vengono prelevate con una pipetta di vetro e poste su di un vetrino portaoggetto, si aggiunge anche una goccia di liquido di Lugol sul vetrino con lo scopo di paralizzare le larve che così si distendono permettendo un’adeguata valutazione morfometrica. Il vetrino viene osservato al microscopio e seguendo le chiavi identificative fornite dal Manual of Veterinary Parasitology Laboratory Techniques (MAFF, 1986) è possibile risalire al genere a cui appartengono i parassiti.
4.1.i) Analisi Statistica
I dati ottenuti dalle colture trattate con i diversi principi attivi testati sono stati confrontati fra loro, con quelli ottenuti dai controlli non trattati e con quelli ottenuti dai controlli trattati con Tiabendazolo e sono stati statisticamente analizzati mediante il Test Χ² (Glantz, 2003a) usando software Mc Graw Hill (Glantz, 2003b).
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4.2 PROVE IN VIVO
Per la valutazione in vivo dell’efficacia dei principi naturali è stata utilizzata la tecnica del FECRT che valuta la riduzione, dopo il trattamento, delle uova di parassiti emesse con le feci dagli animali parassitati (Boersema, 1983; Presidente, 1985; Coles et al., 1992; Taylor et al., 2002). In queste prove sono stati valutati l’estratto di aloe e l’acido glicirretico, sia per la buona efficacia dimostrata nelle prove in vitro, sia per la bassa tossicità di entrambe le sostanze; infatti per quanto riguarda l’Aloe arborescens non sono stati riscontrati effetti tossici in ratti trattati con dosaggi fino a 109,7 mg/kg/die (Matsuda et al., 2007), mentre per l’acido glicirretico è stata calcolata una DL50 (dose letale 50) nel ratto superiore ai 3g/kg in somministrazione orale ed una DL50 in iniezione intraperitoneale nel topo di 1,8 g/kg (www.carloanibaldi.com).
4.2.a) Animali
Per effettuare questo test è stato utilizzato un piccolo gregge di 15 capi di ovini adulti meticci di razze da carne, parassitati naturalmente da strongili gastrointestinali ed allevati nelle colline attorno ad Aulla in provincia di Massa Carrara.
Si tratta di un allevamento di tipo stanziale che prevede sia il pascolo sui terreni aziendali costituiti da pascoli collinari polifiti, sia integrazioni in stalla di fieno e concentrati soprattutto nei periodi sfavorevoli allo sviluppo della vegetazione.
Gli animali non hanno ricevuto nessun trattamento con farmaci antielmintici da almeno due anni prima dell’esperimento.
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4.2.b) Trattamento
Gli animali sono stati suddivisi in tre gruppi composti rispettivamente da 4, 5 e 6 pecore di cui il primo gruppo è stato trattato con acido glicirretico, il secondo con l’estratto di aloe, mentre il terzo non è stato trattato ed ha svolto il ruolo di controllo.
L’aloe e l’acido glicirretico sono stati diluiti con acqua di fonte e sono stati somministrati, alla dose di 1 mg di principio per chilogrammo di peso vivo, per via orale tramite una siringa da 60 cc sprovvista di ago con cui è stato possibile spingere direttamente in faringe il composto. Per l’aloe sono state fatte tre somministrazioni distanziate da 24 ore l’una dall’altra, mentre per l’acido glicirretico è stata fatta un’unica somministrazione.
4.2.c) Valutazione dell’efficacia in vivo
Per valutare l’efficacia delle sostanze in esame è stato utilizzato il test della riduzione della conta fecale o Fecal Egg Count Reduction Test (FECRT) seguendo le linee guida della World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.).
Innanzitutto è stato eseguito uno screening copro-parassitologico per valutare la carica parassitaria degli animali e suddividerli nei tre gruppi e poi si è proceduto con la sperimentazione.
Appena prima del trattamento (giorno 0) e 14 giorni dopo (giorno 14) sono stati raccolti campioni fecali dall’ampolla rettale di ciascun animale su cui è stato effettuato l’esame copro-microscopico individuale.
Tutti gli esami coprologici sono stati eseguiti usando la tecnica di Mc Master modificata e con una sensibilità pari a 50 UPG: sono stati
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stemperati 4 g di feci in 56 ml di soluzione satura di NaCl su di un colino da tè dentro una capsula di porcellana, dopo aver ottenuto una sospensione omogenea la si mescola accuratamente e poi con una pipetta Pasteur si pone fra i due vetrini della camera e si lascia riposare per una decina di minuti; infine si osserva il vetrino al microscopio e si contano le uova presenti all’interno della griglia.
4.2.d) Copro-colture
Per poter identificare a livello di genere gli strongili gastrointestinali che interessavano gli animali utilizzati per la prova in vivo, sono state allestite anche delle copro colture secondo il metodo descritto da
Henriksen e Korsholm (1983) in modo da ottenere le larve allo stadio L3.
Sono stati utilizzati bue bicchieri di plastica di cui uno è stato tagliato a metà e sul fondo sono stati fatti dei forellini per garantire il passaggio dell’aria. Sono stati preparati dei pool fecali di circa 5 g che sono stati deposti sul fondo del bicchiere tagliato. Sulla superficie libera è stata posta una garza fissata capovolgendo l’altra metà del bicchiere ed incastrandola con il fondo. Nell’altro bicchiere viene messa dell’acqua di fonte e vi si incastra la struttura creata capovolgendola, stando però attenti che l’acqua, che deve garantire l’umidità necessaria per lo sviluppo dei parassiti, non lambisca la garza con le feci. Nel caso di feci troppo asciutte è stata aggiunta un po’ d’acqua, mentre in caso di feci diarroiche è stato utilizzato carbone vegetale per assorbire l’umidità in eccesso. La copro-coltura viene lasciata al buio ed alla temperatura di
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20-22°C per circa 10 giorni, al termine dei quali sono stati allestiti, con il campione fecale, un apparato di Baerman per raccogliere le larve L3 che si sono sviluppate. L’apparato di Baerman è costituito da un piccolo imbuto alla cui estremità sottile viene apposta una provetta, l’imbuto viene riempito per ¾ con acqua di fonte e sul pelo dell’acqua viene posta una retina a maglie fini su cui viene appoggiato il campione fecale; si lascia il tempo alle larve di migrare e di portarsi sul fondo della provetta la quale dopo 24 ore viene prelevata ed il contenuto viene versato in una piastra Petri per essere osservato allo stereoscopio. Le larve sono state identificate con le chiavi identificative fornite dal Manual of Veterinary Parasitology Laboratory Techniques (MAFF, 1986).
4.2.e) Analisi Statistica
I dati relativi alle prove in vivo sono stati convertiti mediante la formula
y=log(FEC+25) per ottenere una normale distribuzione di essi (Baker,
1997) ed analizzati mediante Analisi della Varianza (Glantz 2003a) e del Test di Student-Newman-Keuls per confronti multipli (Glantz 2003a) usando software Mc Graw-Hill (Glantz 2003b).
