1.2. Gene targeting

INDICE

1. INTRODUZIONE

pag. 1

1.1. La Terapia Genica

pag. 1 1.1.1 Terapia genica su cellule somatiche pag. 2

1.2. Gene targeting

pag. 3 1.2.1 Ricombinazione omologa e non omologa pag. 4

1.3. Terapia genica e gene targeting

pag. 9 1.3.1 Metodiche per inserire il gene esogeno nelle cellule

pag. 10

1.4. Virus adeno associato

pag. 10

1.4.1 Organizzazione del genoma di AAV pag. 11 1.4.2 Vettori derivati dal virus adeno-associato (rAAV)

pag. 13

1.5. Gene targeting basato su rAAV

pag. 18 1.5.1 Problematiche relative ai vettori rAAV pag. 21

1.6. Il lievito Saccharomyces cerevisiae

pag. 25

2. SCOPO DELLA TESI

pag. 29

3. MATERIALI E METODI

pag. 31

3.1. Plasmidi utilizzati

pag. 31

3.1.1 pJZ102 pag. 31

3.1.2 pCMV-MCS pag. 31 3.1.3 pSub201 pag. 32 3.1.4 pGAD4242 e pGRep68 pag. 33 3.1.5 YEplac181 e YEplac195 pag. 34

3.2. Enzimi di restrizione

pag. 35

3.3 Elettroforesi su geli di agarosio

pag. 36

3.4 Reazione di ligazione

pag. 37

3.5 Trasformazione batterica

pag. 38

3.6 PCR

pag. 41

3.7 Disegno primer

pag. 43

3.8 Ceppo di lievito

pag. 44 3.8.1 Composizione dei terreni pag. 44

3.9 Trasformazione lievito

pag. 47

3.10 Estrazione e purificazione del DNA genomico

pag. 49

3.11 Southern Blot

pag. 51

3.11.1 Preparazione del blot pag. 54 3.11.2 Ibridazione della membrana con la sonda pag. 55 3.11.3 Detection pag. 55

3.12 Sequenziamento

pag. 60

3.12.1 Analisi di sequenze al computer pag. 61

4. RISULTATI

pag. 62

4.1 Costruzione del plasmide pAAV-LUL

pag. 62

4.2 Effetto delle ITR sul gene targeting e sulla random integration

pag. 65

4.3 Effetto dell’espressione della proteina virale Rep68 sulla integrazione di AAV

pag. 70

4.4 Caratterizzazione molecolare della random integration

pag. 73

4.5 Analisi dei siti di integrazione

pag. 77

5. DISCUSSIONE

pag. 83

6. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE

pag. 89

7. BIBLIOGRAFIA

pag. 91

RINGRAZIAMENTI

pag. 103