Doctorate Course in Sciences and Technologies of Chemistry and Materials Curriculum: Pharmaceutical, Food and Cosmetic Sciences
XXIX Cycle
PhD Thesis
"Valorizzazione di alimenti e scarti agro-alimentari
mediante tecniche innovative eco-compatibili e
formulazione di nuovi prodotti arricchiti e / o
funzionali"
Tutor PhD Student Prof. Paola Zunin Dr. Federica Turrini
INDICE
Introduzione ________________________________________ 1
Capitolo 1: Preparazione di olive arricchite mediante
impregnazione sottovuoto
1.1 Introduzione _____________________________________ 5
1.1.1 Le olive come substrato di impregnazione sottovuoto _____ 5
1.1.2 Gli alimenti funzionali ______________________________ 8
1.1.2.1 Classificazione degli alimenti funzionali __________________ 9 1.1.2.2 Principali tecnologie utilizzate per la realizzazione di alimenti
funzionali
______________________________________
121.1.3 La microstruttura degli alimenti _____________________ 13
1.1.4 L’impregnazione sottovuoto ________________________ 14
1.1.4.1 Fattori che influenzano il processo di VI _________________ 15 1.1.4.2 Caratteristiche fondamentali della soluzione di VI _________ 16 1.1.4.3 Applicazioni sperimentali della VI ______________________ 17
1.1.5 La carenza di ferro: un problema clinico, sociale e di politica
sanitaria ___________________________________________ 19
1.1.5.1 Le strategie terapeutiche per contrastare la carenza di ferro _ 21 1.1.5.2 La fortificazione degli alimenti con ferro _________________ 23
1.1.6 Il FeNaEDTA quale fonte di Ferro per l’arricchimento degli
alimenti ____________________________________________ 24
1.2 Scopo del lavoro _________________________________ 26
1.3 Parte sperimentale _______________________________ 27
1.3.1 Campioni ______________________________________ 27
1.3.2 Reagenti chimici ________________________________ 28
1.3.2.1 Preparazione della soluzione estraente il ferro ____________ 28 1.3.2.2 Preparazione della soluzione cromogena ________________ 28
1.3.4 Preparazione delle olive arricchite ___________________ 29
1.3.5 Determinazione del contenuto di ferro delle olive arricchite 30
1.3.6 Analisi Spettrofotometrica Uv-Vis ___________________ 30
1.3.7 Disegno sperimentale e analisi statistica ______________ 30
1.4 Risultati e Discussione ___________________________ 32
1.4.1 D-Optimal Design _______________________________ 33
1.4.2 Full-Factorial Design _____________________________ 38
1.4.3 Central Composite Design _________________________ 42
1.4.4 Prove di assaggio delle olive arricchite con il ferro ______ 46
1.4.5 Interpretazione delle superfici di risposta e discussione dei
risultati ____________________________________________ 47
1.5 Conclusioni _____________________________________ 49
1.6 Bibliografia _____________________________________ 50
Capitolo 2: Valorizzazione dei prodotti di scarto del
melograno mediante estrazione green e riutilizzazione della
sua frazione fenolica nella produzione di alimenti funzionali
2.1 Introduzione ____________________________________ 54
2.1.1. Il melograno: da frutto antico a Superfrutto ____________ 54
2.1.2 Origine del melograno e diffusione mondiale ___________ 55
2.1.3 Tassonomia e sistematica del genere Punica __________ 57
2.1.4 Cenni di botanica ________________________________ 57
2.1.5 Composizione chimica del melograno ________________ 59
2.1.5.1 Composti fenolici ___________________________________ 64 2.1.5.2 Metabolismo degli ellagitannini ________________________ 67
2.1.6 Proprietà funzionali del melograno __________________ 68
2.2 Tecniche _______________________________________ 70
2.2.1.1 Estrazione assistita con ultrasuoni _____________________ 71 2.2.1.2 Estrazione assistita con microonde ____________________ 75
2.2.2 Tecniche di formulazione __________________________ 77
2.2.2.1 Lo Spray-drying come tecnica di formulazione e stabilizzazione di matrici vegetali _________________________________________ 77
2.2.3 Tecniche analitiche ______________________________ 79
2.2.3.1 La spettroscopia UV-Vis per la determinazione della riflettanza diffusa _________________________________________________ 79
2.3 Scopo del lavoro _________________________________ 83
2.4 Parte sperimentale _______________________________ 85
A) Studio di comparazione di diverse tecniche “green” per
l’estrazione di composti bioattivi polifenolici da scarti di
spremitura del melograno ____________________________ 85
2.4.1 Campioni ______________________________________ 85
2.4.2 Reagenti chimici ________________________________ 86
2.4.3 Tecniche estrattive “green” da scarti di spremitura ______ 86
2.4.3.1 Estrazione assistita con ultrasuoni (UAE) ________________ 87 2.4.3.2 Estrazione assistita con microonde (MAE) _______________ 88
2.4.4 Determinazioni effettuate sugli estratti acquosi _________ 88
2.4.4.1 Determinazione del contenuto di polifenoli totali (TPC) _____ 88 2.4.4.2 Determinazione dell’attività antiradicalica (RSA) __________ 89 2.4.4.3 Determinazione del contenuto di acido ellagico ___________ 90
2.4.5 Preparazione di un prodotto alimentare arricchito _______ 91
2.4.5.1 Analisi colorimetrica delle fettine di mela ________________ 91
2.4.6 Preparazione di un prodotto cosmetico arricchito _______ 92
2.4.6 Analisi statistica _________________________________ 93
B) Studio di formulazione degli estratti ottenuti dallo scarto
edibile del melograno e loro successivo impiego nella
realizzazione di alimenti funzionali _____________________ 94
2.4.7 Campioni ______________________________________ 94
2.4.8 Estrazione assistita con ultrasuoni (PUAE) ____________ 95
2.4.9 Caratterizzazione degli estratti acquosi _______________ 95
2.4.9.1 Determinazione del contenuto totale di antocianine (TAC) __ 95 2.4.9.2 Determinazione del contenuto di tannini idrolizzabili _______ 96 2.4.9.3 Determinazione del contenuto di altre sostanze polifenoliche 97 2.4.9.4 Determinazione dell’attività antiaggregante sulle piastrine umane _________________________________________________ 97
2.4.10 Microdispersione degli estratti acquosi ______________ 98
2.4.10.1 Analisi delle microparticelle __________________________ 99
2.4.11 Studio di arricchimento di spicchi di mela freschi ______ 100
C) Studio preliminare di caratterizzazione di due diverse
cultivar di melograni certificati italiani e dei relativi estratti
ottenuti dalle bucce esterne _________________________ 102
2.4.12 Campioni ____________________________________ 102
2.4.13 Essiccamento ed estrazione delle bucce esterne _____ 105
2.4.14 Caratterizzazione degli estratti ____________________ 106
2.5 Risultati e Discussione __________________________ 107
2.6 Conclusioni ____________________________________ 137
2.7 Bibliografia ____________________________________ 138
Capitolo 3: Valutazione delle proprietà antiossidanti di una
nuova varietà italiana di riso colorato e ottimizzazione di un
processo estrattivo eco
– compatibile dei suoi composti
fenolici a partire dalle cariossidi e dalle foglie
3.1 Introduzione ___________________________________ 144
3.1.1. Il riso: il cereale più diffuso al mondo _______________ 144
3.1.2 La lavorazione del riso ___________________________ 147
3.1.3 Composizione chimica e nutrizionale del riso _________ 148
3.1.4 Contenuto di sostanze antiossidanti nelle diverse tipologie di
riso ______________________________________________ 150
3.1.5 I risi colorati ___________________________________ 151
3.1.5.1 Il riso ‘Violet Nori’ _________________________________ 153
3.2 Scopo del lavoro ________________________________ 155
3.3 Parte sperimentale ______________________________ 156
3.3.1 Campioni _____________________________________ 156
3.3.2 Reagenti _____________________________________ 156
3.3.3 Apparecchiature ________________________________ 156
3.3.4 Disegno sperimentale ___________________________ 157
3.3.5 Preparazione degli estratti ________________________ 157
3.3.6 Determinazioni effettuate sugli estratti _______________ 158
3.3.7 Determinazione del contenuto di antocianine mediante
HPLC ____________________________________________ 158
3.3.8 Determinazione della capacità antiossidante mediante
metodica ORAC ____________________________________ 159
3.4 Risultati e Discussione __________________________ 160
3.4.1 Prove preliminari _______________________________ 160
3.4.2 Ottimizzazione delle condizioni dell’estrazione con ultrasuoni
_________________________________________________ 163
3.4.3 Analisi
delle cariossidi e delle farine di riso ‘Violet Nori’ e
confronto con le cariossidi di altre varietà di risi pigmentati ___ 168
3.4.4 Analisi delle foglie di ‘Violet Nori’ ___________________ 171
3.5 Conclusioni ____________________________________ 175
3.6 Bibliografia ____________________________________ 177
Capitolo 4: Altri prodotti alimentari
4.1 Altri prodotti alimentari __________________________ 182
4.1.1 I gemmoderivati: una categoria di integratori alimentari e
nutraceutici preziosi _________________________________ 182
4.1.2 Latti in polvere per neonati: valutazione della composizione
in acidi grassi e loro stabilità all’ossidazione _______________ 185
4.1.3 Il tè verde: la spettroscopia a fluorescenza accoppiata a
tecniche chemiometriche per l'autenticazione e la discriminazione
della tipologia di tè in base alla sua origine geografica _______ 186
Conclusioni _______________________________________ 187
Pubblicazioni _____________________________________ 189
1
Introduzione
Durante il mio dottorato di ricerca ho lavorato su diversi progetti sotto la supervisione della Prof.ssa Paola Zunin e della Prof.ssa Raffaella Boggia.
Il principale obiettivo del mio lavoro è stata la valorizzazione di alcuni alimenti e scarti agro-alimentari nell’ottica della formulazione di nuovi prodotti arricchiti e / o funzionali, sia in ambito alimentare che cosmetico.
In particolare, le linee di ricerca che ho seguito hanno avuto come oggetto diverse matrici alimentari, tra cui:
• Le olive come substrato per la realizzazione di un alimento arricchito;
• Il melograno ed in particolare la valorizzazione ed il recupero dei sottoprodotti derivanti dalla produzione del succo, come potenziali fonti di composti bioattivi polifenolici;
• Il riso ‘Violet Nori’, una varietà autoctonapiemontesedi riso colorato ad elevato contenuto in antocianine preziose che lo rende un prodotto ad importante valore aggiunto oltre ad un lavoro di valorizzazione delle foglie di tale pianta.
Presupposto comune per questi studi è stato lo sviluppo e l’utilizzo di tecniche estrattive innovative, a basso impatto ed eco – compatibili sia in accordo con i principi della green chemistry (EPA) sia di un’economia sostenibile e circolare.
Le olive, che rappresentano un prodotto tipico della Regione Liguria, sono state utilizzate come substrato per la realizzazione di un alimento arricchito con Ferro mediante l’utilizzo dell’impregnazione sottovuoto (Vacuum impregnation, VI).
Lo spunto per intraprendere questo lavoro è stata la crescente necessità di avere a disposizione alimenti fortificati con ferro a causa del costante ed importante aumento delle diete vegetariane e vegane in Italia e nel mondo.
Tramite la VI è stato possibile ottenere un prodotto arricchito che consente di introdurre una quantità di ferro pari al fabbisogno giornaliero mediante l’assunzione di pochi frutti.
Il lavoro ha dimostrato come una tecnica innovativa e rapida, quale la VI, possa apportare un reale contributo all’arricchimento degli alimenti con sostanze fisiologicamente utili e alla realizzazione di alimenti funzionali destinati ad una specifica fetta di consumatori.
2 La seconda linea di ricerca si è focalizzata sul frutto del melograno di cui sono già note numerose proprietà funzionali e salutistiche.
I sottoprodotti derivanti dalla lavorazione del succo di melograno rappresentano sia un importante ed oneroso problema di smaltimento legato alle ingenti quantità prodotte sia una promettente fonte di potenziali nutraceutici. In particolare, sia le bucce (esocarpo) che lo scarto interno ottenuto dopo la spremitura del succo, ossia i residui di mesocarpo, endocarpo e arilli, solitamente scartati, hanno dimostrato di essere ancora una buona fonte di polifenoli.
A fini estrattivi sono state impiegate alcune tecnologie green, come l'estrazione assistita con ultrasuoni (UAE) e l'estrazione assistita con microonde (MAE), utilizzando solventi eco-compatibili, per convertire tali residui organici in prodotti ad alto valore aggiuntoe, conseguentemente, per la messa a punto di un processo di riciclo agronomico applicabile a livello industriale. Gli estratti liquidi ottenuti sono stati essiccati e formulati mediante la tecnologia Spray-drying e successivamente, utilizzati quali ingredienti funzionali in un alimento modello mediante la VI.
Il colore viola intenso delle cariossidi e delle foglie della varietà ‘Violet Nori’ hanno invece stimolato l’inizio di uno studio volto al recupero dei composti ad attività antiossidante da tali prodotti.
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un metodo economico ed eco-compatibile per l’estrazione delle antocianine e di altri composti antiossidanti idrofili dalle cariossidi, dalle farine e dalle foglie del riso ‘Violet Nori’ ed effettuare un confronto oltre che tra i prodotti della varietà ‘Violet Nori’ anche con estratti di cariossidi di altre tipologie di risi colorati reperibili sul mercato locale.
Lo studio effettuato sulle cariossidi ha confermato il loro interesse come fonti di antocianine e di altri composti antiossidante, apparsi spesso maggiori che in altre varietà di riso colorato. Lo studio effettuato sulle foglie, un sottoprodotto della produzione del riso, ha dimostrato il loro interesse in vista di un loro potenziale impiego come materia prima a basso costo per l’estrazione di antocianine preziose per uso alimentare, nutraceutico e cosmeceutico.
La mia attività di ricerca ha più marginalmente riguardato anche lo studio di altri prodotti alimentari come:
• I gemmo derivati, una categoria di prodotti naturali classificati nella Comunità europea come integratori alimentari a base erboristica, ottenuti per macerazione dei tessuti meristematici freschi di alberi e piante erbacee i quali differentemente dalle corrispondenti parti adulte vantano
3 elevati contenuti in composti nutritivi che conferiscono ai prodotti derivati un elevato valore aggiunto;
• Alcune tipologie di latti in polvere destinati ai neonati al fine di individuarne la composizione di acidi grassi (totali e "liberi" ossia incapsulati) e valutarne il grado di ossidazione a seguito dell'apertura della confezione;
• Il tè verde utilizzando la spettroscopia a fluorescenza, una tecnica veloce, non distruttiva ed economica, abbinata alla chemiometria per l'autenticazione e la discriminazione della tipologia di tè in base alla sua origine geografica.
4
CAPITOLO 1
“Preparazione di olive arricchite
5
1.1 Introduzione
1.1.1 Le olive come substrato di impregnazione sottovuoto
L'Olivo (Olea Europaea L.) è un albero da frutto utilizzato fin dall'antichità per l'alimentazione.
Le olive, i suoi frutti, sono impiegate prevalentemente per l'estrazione dell'olio, sebbene in misura minoritaria trovino un impiego diretto nell'alimentazione come olive da tavola o in salamoia.
Trattasi di un albero sempreverde e latifoglia coltivato fin dai tempi delle antiche civiltà nelle regioni del Mediterraneo orientale. Si ritiene sia originario dell'Asia Minore e della Siria, proprio perché in queste regioni l'olivo selvatico o oleastro (Olea Europeae Oleaster) è molto comune ed abbondante. La pianta coltivata (Olea Europeae Sativa) deriva dall’oleastro il quale cresce in luoghi
rupestri, isolato o in forma boschiva, e dai cui minuscoli frutti si ottiene un olio amaro e di limitato impiego in ambito alimentare.
Ad oggi, la coltivazione delle olive è estesa a tutte le regioni che vantano un clima mediterraneo: Italia, Spagna e Grecia si configurano i principali produttori mondiali. Altri importanti produttori di olive sono Portogallo, Turchia, Tunisia, Francia, Marocco, Algeria, Siria, Jugoslavia, Stati Uniti, Cipro, Israele, Argentina e Libia.
L’oliva consiste in una drupa globosa, ellissoidale, ovoidale o asimmetrica a seconda della varietà. Nel frutto è possibile distinguere le seguenti parti:
•
L’epicarpo o buccia, che rappresenta la parte esterna, costituisce l’1-2 % del frutto ed è protetta da uno strato ceroso;•
Il mesocarpo, che rappresenta la polpa interna, (63-86 %) e contiene la maggior parte dell’olio;•
L’endocarpo o nocciolo (10-13 %) costituito da un guscio legnoso contenente il seme (2-6 %) (Figura 1).6
Figura 1: Struttura dell’oliva.
Il frutto raggiunge il suo peso massimo circa 6 - 8 settimane dopo la sua maturazione in primavera e cambia nel tempo diverse colorazioni fino al raggiungimento della caratteristica tonalità viola-nera a completa maturazione. L’acqua e la frazione lipidica costituiscono l’85 - 90 % del peso della polpa del frutto maturo, mentre la restante parte è costituita da altri composti organici e minerali. Particolarmente abbondanti nella polpa sono i monosaccaridi (glucosio, mannosio, xilosio, galattosio e arabinosio) ed il potassio. Gli acidi organici (citrico, malico, ossalico, malonico, fumarico, tartarico, lattico e acetico) sono presenti a bassa concentrazione nel mesocarpo a differenza dei composti fenolici che abbondano a livello della polpa ma si ritrovano anche in altre parti della drupa quali la buccia ed il seme. Tra questi, il composto maggioritario tipico dell’oliva e responsabile del suo caratteristico sapore amaro è l’oleouropeina.
Le principali varietà di olive utilizzate per l’estrazione dell’olio sono:
• Arauco; • Bouquetier; • Corfolia; • Dafnolia; • Fratoio; • Koroneiki; • Lechin; • Manzanillo;
7 • Morcal; • Nevadillo; • Picual; • Rozzola; • Rougette; • Smertolia; • Taggiasca; • Tsounati; • Zorzalena.
Le varietà invece preferite per la produzione di olive da tavola sono quelle aventi un contenuto complessivo di olio inferiore all’8 % ossia:
• Ascolano; • Calamata; • Chalkidikis; • Conservolea; • Gordal; • Hojiblanca; • Manzanillo; • Megariticci; • Mission; • Sevillano; • Throumbolia; • Verdale;
• Volou (Macrae, Robinson, & Sadler, 1993).
Il principale motivo per cui si è scelto di utilizzare l’oliva per questo lavoro è legato al fatto che essa è un prodotto tipico del nostro territorio e per questo facilmente reperibile. In Liguria, infatti, l’insediamento dell’olivo si sviluppa lungo l’intero territorio regionale, dalle fasce costiere alle zone collinari più interne.
Oltre a questa caratteristica fondamentale, un altro fattore determinante nella scelta dell’oliva è stata la porosità della sua polpa che, come verrà affrontato nel paragrafo 1.1.4.1, è un requisito fondamentale che deve avere un prodotto per poter essere suscettibile di impregnazione mediante Vacuum Impregnation.
8
1.1.2 Gli alimenti funzionali
Il termine "alimento funzionale"
(
functional food)
è stato utilizzato per la prima volta nel 1984 in Giappone a seguito di uno studio sulle relazioni tra nutrizione, soddisfazione sensoriale, fortificazione e modulazione dei sistemi fisiologici con lo scopo di sottolineare gli effetti benefici che tali prodotti alimentari avevano dimostrato sulla salute umana (Kwak & Jukes, 2001).Un alimento funzionale è definito come “Un alimento o un ingrediente presente nell’alimento stesso che in virtù dei nutrienti che contiene può apportare benefici sullo stato di salute” (Mazza, 1998).
Quello degli alimenti funzionali è un settore emergente nel campo dell'alimentazione e l’interesse per questi prodotti sta esponenzialmente aumentando in tutto il mondo, soprattutto nei paesi industrializzati (Bech-Larsen & Scholderer, 2007) come dimostrato dall’aumento della ricerca scientifica su di essi (vedi Figura 2).
Figura 2: Trend delle pubblicazioni scientifiche relative agli alimenti funzionali nel decennio 2000-2010.
Negli ultimi decenni, infatti, le esigenze dei consumatori nel campo degli alimenti sono cambiate notevolmente. Ad oggi, un numero sempre maggiore di consumatori ritiene che gli alimenti non siano destinati esclusivamente a soddisfare la fame ma forniscano nutrienti fondamentali per l’uomo e
9 contribuiscano direttamente alla sua salute, migliorandone il benessere sia fisico che mentale e riducendone il rischio di malattia (E. Betoret, Betoret, Vidal, & Fito, 2011). La crescente domanda del mercato di tali prodotti alimentari può essere spiegata dal crescente costo delle cure sanitarie, dall'aumento costante dell’aspettativa di vita e dal desiderio delle persone anziane di migliorare la qualità dei loro anni.
Secondo l'Organizzazione mondiale della sanità (WHO) e l'Organizzazione per l'alimentazione e l'agricoltura (FAO), le abitudini alimentari, associate allo stile di vita, in genere costituiscono importanti e modificabili fattori di rischio per lo sviluppo di differenti patologie tra cui le malattie cardiache, il cancro, il diabete di tipo 2, l’obesità, l’osteoporosi e la malattia paradontale.
Secondo un’indagine condotta da Euromonitor (Euromonitor, 2004), il principale fornitore mondiale di ricerche strategiche di mercato, il più grande mercato mondiale degli alimenti funzionali risulta essere il Giappone, seguito dagli Stati Uniti, mentre il mercato europeo appare per ora meno sviluppato. In Giappone, considerato il luogo di nascita degli alimenti funzionali, solo nel decennio tra il 1988 e il 1998 si stima che siano stati lanciati più di 1700 alimenti funzionali.
Bech-Larsen et al. (2007), invece, hanno evidenziato che i principali mercati degli alimenti funzionali a livello europeo sono il Regno Unito, la Germania, la Francia e l’Italia, sebbene il mercato europeo risulti alquanto eterogeneo e caratterizzato da grandi differenze regionali per ciò che riguarda l’uso e l'accettazione di tali prodotti (ad esempio, l'interesse nei confronti degli alimenti funzionali è maggiore da parte dei consumatori dei paesi dell'Europa settentrionale rispetto a quelli dei Paesi del Mediterraneo).
1.1.2.1 Classificazione degli alimenti funzionali
La letteratura esistente propone differenti classificazioni degli alimenti funzionali. Kotilainen, Rajalahti, Ragasa, & Pehu, (2006) hanno proposto la seguente:
• Alimenti fortificati con nutrienti addizionali (etichettati come prodotti fortificati), come ad esempio succhi di frutta fortificati con vitamina C, vitamina E, acido folico, zinco e calcio;
• Alimenti contenenti nuovi nutrienti o componenti non naturalmente presenti (etichettati come prodotti arricchiti), come ad esempio probiotici o prebiotici;
10
• Alimenti da cui una componente potenzialmente dannosa è stata rimossa, ridotta o sostituita da un’altra avente un effetto benefico (etichettati come prodotti “modificati”);
• Alimenti in cui uno dei componenti naturalmente presenti è stato aumentato (etichettati come prodotti avanzati), ad esempio le uova aventi un maggior contenuto di omega-3.
Secondo una classificazione alternativa basata non tanto sul prodotto quanto sugli effetti di questi sulla salute umana, gli alimenti funzionali possono essere classificati in:
• Alimenti che migliorano la qualità della vita, come ad esempio prebiotici e probiotici;
• Alimenti che riducono un problema di rischio sanitario reale, come ad esempio i prodotti che abbassano il colesterolo e/o la pressione arteriosa;
• Alimenti che facilitano la vita, come ad esempio i prodotti senza lattosio o senza glutine che per alcuni consumatori sono essenziali.
In Figura 3 (Bigliardi & Galati, 2013) sono riportate le principali categorie di alimenti funzionali corredate dai riferimenti bibliografici.
11
Figura 3: Principali categorie di alimenti funzionali, loro effetti, esempi e riferimenti bibliografici.
I probiotici risultano essere i prodotti più incidenti sul mercato mondiale degli alimenti funzionali con più di 370 prodotti lanciati nel mondo solo nell’anno 2005. Il mercato globale degli alimenti funzionali, infatti, è aumentato da $33 miliardi nel 2000 a $176,7 miliardi nel 2013, rappresentando il 5% del mercato alimentare globale. Si stima che gli alimenti probiotici rappresentino tra il 60% ed il 70% del mercato complessivo degli alimenti funzionali (Tripathi & Giri, 2014).
12
1.1.2.2 Principali tecnologie utilizzate per la realizzazione di
alimenti funzionali
Le principali tecnologie sia emergenti che tradizionalmente utilizzate in ambito alimentare per la realizzazione di alimenti funzionali sono state classificate da Betoret et al. (2011) in tre grandi gruppi:
• Tecnologie tradizionalmente utilizzate nei processi di produzione alimentare;
• Tecnologie designate a prevenire il deterioramento dei composti fisiologicamente attivi;
• Nuove tecnologie designate alla realizzazione di alimenti funzionali personalizzati.
Per quanto riguarda le tecniche tradizionali, la formulazione e la miscelazione costituiscono delle tecniche semplici ed economiche storicamente utilizzate in questo settore per realizzare alimenti addizionati di vitamine e/o minerali (soprattutto vitamina A, vitamina D, vitamine del gruppo B quali tiamina, riboflavina, niacina, iodio e ferro) per far fronte alle più comuni ed importanti carenze nutrizionali (ad esempio, si pensi all’introduzione sul mercato del sale da cucina arricchito di iodio agli inizi del 1920).
Anche le tecniche di coltivazione e di allevamento animale essendo i prodotti dell’agricoltura ed il bestiame le primarie fonti di nutrienti per l'uomo rientrano tra le tecniche tradizionalmente utilizzate per preparare alimenti a maggiore valore aggiunto. I progressi effettuati nel corso degli anni nell’ambito della biotecnologia e della biologia molecolare hanno offerto nuove vie tramite cui modificare la composizione degli alimenti.
Tra le tecnologie progettate per prevenire il deterioramento dei composti fisiologicamente attivi il più dibattuto nella letteratura scientifica è la microincapsulazione, che consiste nell'incapsulamento di piccole particelle solide, goccioline liquide o di un gas all’interno di un rivestimento sfruttando le ottime capacità di incorporazione delle matrici polimeriche. In alternativa alla microincapsulazione, sono utilizzati anche, come rivestimento, dei film edibili che aumentano la shelf-life del prodotto preservandolo da contaminati patogeni e possono essere mangiati dal consumatore con l’alimento stesso.
L’impregnazione sottovuoto utilizzata per l’arricchimento delle olive è considerata una tecnica utile per introdurre soluti nella struttura porosa degli alimenti modificandone la loro composizione originaria.
La nutrigenomica è invece una scienza innovativa che considera l'interazione tra gli alimenti ed il genoma umano, riconoscendo che un consiglio
13 nutrizionale adeguato a un individuo può essere invece inappropriato per un altro. Tale tecnologia può offrire grandi opportunità nel campo della funzionalizzazione degli alimenti, sebbene ad oggi molti aspetti non siano ancora ben chiariti e ci siano solo limitati esempi di sperimentazioni cliniche che utilizzano tali tecniche innovative, quindi vi sono ancora un numero considerevole di questioni che devono essere affrontate prima che l'approccio genomico possa diventare un metodo accettabile per guidare lo sviluppo di nuovi prodotti alimentari (Bigliardi & Galati, 2013).
1.1.3 La microstruttura degli alimenti
L’interesse degli scienziati alimentari nel campo della microstruttura è cresciuto esponenzialmente dopo il riconoscimento dell’importanza che le reazioni chimiche e i fenomeni fisici, che si verificano su scala microscopica, hanno sulla sicurezza e la qualità degli alimenti.
Questo concetto è ben riassunto da Aguilera (2005) che afferma che:
“…la maggior parte dei fattori che partecipano in modo cruciale alle proprietà di trasporto, al comportamento fisico e reologico, alle caratteristiche strutturali e
sensoriali dei cibi, sono al di sotto del range dei 100 µm”.
Prima di questo riconoscimento scientifico, gli scienziati alimentari che avevano concentrato i loro sforzi sullo studio degli effetti che i processi industriali tradizionali e innovativi avevano sulla qualità degli alimenti, avevano analizzato solo indici macroscopici come il colore, la consistenza, il gusto, la concentrazione di diversi composti nutrizionali, ecc…, senza considerare che essi sono essenzialmente il risultato di fenomeni chimici e fisici che avvengono a livello microscopico.
Mebatsion et al. (2008) hanno definito tre differenti scale spaziali:
• La macroscala che si riferisce all’alimento nel suo complesso come un insieme di tessuti biologici con proprietà omogenee;
• La mesoscala che si riferisce alla tipologia dei tessuti biologici;
• La microscala che affronta la differenza tra le singole cellule in termini di pareti cellulari, membrane cellulari, organelli interni, ecc.
L’architettura tridimensionale degli alimenti può essere studiata analizzando il rapporto tra fasi vuote e piene, dove i vuoti (capillari, pori) possono essere
14 parzialmente o completamente riempiti con liquidi o gas. Le relazioni tra queste due fasi e i loro cambiamenti durante il trattamento sono tra i fattori più importanti che riguardano la sicurezza e la qualità sensoriale e nutrizionale degli alimenti. Inizialmente, solo la frazione di porosità degli alimenti è stata studiata come indice della microstruttura interna, tuttavia, essa ci fornisce solo un preliminare livello di informazione. Invece, un secondo livello di caratterizzazione della struttura può essere raggiunto analizzando la dimensione del poro, la forma, la lunghezza, l’irregolarità della superficie, la tortuosità, le possibili connessioni, ecc…
Così, una delle più importanti sfide per il futuro riguarda la caratterizzazione precisa dell’architettura tridimensionale degli alimenti, i suoi cambiamenti durante le fasi di lavorazione e la sua relazione con la sicurezza e la qualità.
Alcuni ricercatori pionieristici hanno concentrato la loro attenzione su questo settore di ricerca e i primi risultati sono stati già riportati in letteratura.
1.1.4 L’impregnazione sottovuoto
Tra i trattamenti innovativi, una delle tecniche più recenti ed importanti che si basa sulle proprietà della microstruttura degli alimenti è sicuramente l’impregnazione sottovuoto (VI).
Tale tecnologia sfrutta la frazione vuota degli alimenti con lo scopo di introdurre, in modo controllato, svariati composti chimici nei pori dei tessuti biologici. La VI, infatti, è basata sull’applicazione di una pressione di vuoto parziale che permette di rimuovere i liquidi naturalmente presenti negli alimenti e/o i gas intrappolati nei capillari e di riempirli successivamente con una soluzione esterna di composizione desiderata dopo il ripristino della pressione atmosferica. Tale scambio avviene per azione di un meccanismo idrodinamico (HDM) promosso dalla variazione di pressione (Fito, 1994), (Fito & Pastor, 1994).
Secondo quanto inizialmente proposto, l’operazione è effettuata all’interno di una camera da vuoto (vedi Figura 4) in 2 fasi successive dopo l’immersione
del prodotto in un serbatoio contenente la fase liquida. Nella prima fase, la pressione di vuoto (p1 circa 50-100 mbar) è imposta al sistema per un breve
periodo di tempo nel serbatoio chiuso, favorendo così l’espansione e la fuoriuscita del gas interno al prodotto. Nella seconda fase, la pressione atmosferica (p2) viene ripristinata nel serbatoio per un tempo (t2) con una
compressione che porta ad una notevole riduzione nel volume del gas rimanente nei pori e quindi al conseguente afflusso di liquido esterno nella struttura porosa (Fito et al., 2001).
15
Figura 4: Schema esplicativo dell’apparecchiatura utilizzata per VI.
Tale trattamento osmotico ha il vantaggio di modificare la composizione del materiale alimentare attraverso la rimozione parziale dell’acqua e l’impregnazione di soluti, senza influenzarne l’integrità strutturale. Durante il processo osmotico ci sono due grandi flussi simultanei controcorrente: il flusso di acqua dal cibo nella soluzione osmotica e il flusso di soluti dalla soluzione nel cibo.
È possibile un’ampia gamma di applicazioni del trattamento di VI attraverso un’appropriata scelta e controllo delle condizioni operative.
1.1.4.1 Fattori che influenzano il processo di
VI
Nel processo di VI sono individuabili tre fenomeni accoppiati: l’efflusso del gas, la deformazione-rilasciamento della matrice solida e l’afflusso del liquido. Le cinetiche di questi fenomeni sono significativamente influenzate dalle seguenti proprietà del materiale (P Fito, Andrb, Chiralt, & Pardo, 1996):
• Struttura del tessuto (pori e distribuzione delle dimensioni, la porosità del materiale è infatti un requisito fondamentale perché la VI sia efficiente);
• Tempo di rilasciamento della matrice solida (funzione delle proprietà meccaniche del materiale);
16
• Velocità di trasporto (in funzione di struttura forma e dimensione dei pori e della viscosità della soluzione);
• Forma e dimensione del campione.
Il processo di VI e la qualità dei prodotti finiti sono anche determinati dalle condizioni di lavorazione tra cui:
• Pretrattamento del campione;
• Temperatura;
• Composizione e concentrazione della soluzione impregnante;
• Pressione d’esercizio;
• Tempo di immersione sottovuoto;
• Tempo per ripristinare la pressione atmosferica;
• Agitazione;
• Geometria dei pezzi di cibo;
• Rapporto soluzione/campione.
1.1.4.2 Caratteristiche fondamentali della soluzione di
VI
La scelta della tipologia della soluzione impregnante è un fattore chiave per questo trattamento osmotico.
Le cellule di tessuto vegetale, infatti, reagiscono in modo diverso a seconda della soluzione in cui vengono poste: ad esempio, quando sono collocate in soluzioni ipertoniche, le cellule avvizziscono a causa della perdita dell’acqua, se invece sono inserite in soluzioni ipotoniche le cellule tendono al rigonfiamento perché il flusso dell’acqua in questo caso procede in direzione contraria. Per tali ragioni, la selezione delle soluzioni per la VI dipende dallo scopo del trattamento osmotico, quindi dal tipo di prodotto finito desiderato, in quanto il tipo di soluzione osmotica influisce significativamente sul trasferimento di massa.
La scelta della soluzione per la VI deve prendere anche in considerazione altri importanti fattori quali atossicità, buone caratteristiche sensoriali, alta solubilità e basso costo. In generale, qualsiasi soluto solubile in acqua o solvente con essa miscibile può essere utilizzato per la soluzione per la VI. Tra questi, sciroppo di amido, glicerolo, etanolo, polioli, maltodestrine, lattosio, trealosio, L-lisina, caseina, glutammato monosodico, e loro combinazioni, come glucosio con saccarosio, glicerolo con saccarosio e saccarosio con sale.
17 La solubilità è un’altra importante caratteristica, in quanto il soluto prescelto deve dissolversi nel sistema usato alla concentrazione e temperatura utilizzate.
Gli effetti della temperatura sulla cinetica di trasferimento di massa possono essere ben predetti dall’equazione di Arrhenius. Un’alta temperatura accelera il processo osmotico, ma d’altro canto, può avere effetti negativi sul colore, la consistenza e il sapore dei campioni. La temperatura ottimale dipende dal tipo di materiale grezzo utilizzato, dal tipo di prodotto finito che si vuole ottenere, e dalla velocità della lavorazione (Zhao & Xie, 2004.)
1.1.4.3 Applicazioni sperimentali della
VI
Il processo di VI può essere utilizzato per introdurre in determinati alimenti diversi composti tra cui:
• Agenti antimbrunimento; • Agenti antimicrobici; • Agenti antiossidanti; • Crioprotettori; • Enzimi; • Minerali; • Vitamine; • Probiotici; • Correttori di acidità.
Gli scopi di tale introduzione possono essere molteplici, come prolungare la durata di conservazione, effettuarepretrattamenti prima dell’essiccazione o del congelamento, arricchire il cibo fresco con sostanze nutrizionali e/o funzionali, ottenere formulazioni alimentari innovative.
Come ben noto, il processo di essiccamento eseguito sia con aria calda sia mediante l’ausilio delle microonde, è caratterizzato da un alto consumo energetico. La possibilità di ridurre la quantità iniziale di acqua nei cibi freschi (acqua libera) tramite un pretrattamento consente di ridurre significativamente il costo del processo.
La VI rispetto ad una semplice disidratazione osmotica, permette inoltre l’introduzione di soluti quali agenti antimicrobici, antimbrunimento ed antiossidanti per migliorare la qualità finale dei cibi essiccati. Fito et al., (2001) hanno riportato un miglioramento del comportamento essiccativo di diversi frutti e verdure sottoposti ad un pretrattamento di VI e diversi altri autori hanno riportato che la stabilità dei pigmenti è stata migliorata senza l’uso dei comuni
18 additivi per la conservazione del colore quando la VI è applicata prima dell’essiccazione.
Tra i processi di stabilizzazione, il congelamento è uno dei più importanti in quanto l’uso di basse temperature permette di conservare al meglio i nutrienti. Tuttavia, la formazione di cristalli di ghiaccio può portare a diversi danni fisici e a gocciolamento durante la fase di scongelamento. Inoltre, la fluttuazione della temperatura lungo la catena del freddo può promuovere fenomeni di ricristallizzazione che possono determinare cambiamenti nella dimensione e nella forma del ghiaccio oltre che nella loro orientazione.
La VI si è rivelata un metodo utile per incorporare nella fase vuota degli alimenti crioprotettori e criostabilizzatori, (ad esempio soluzioni di zucchero ipertoniche, proteine antigelo (AFP), pectine ad alto grado di metossilazione, ecc.). A tal proposito, Martinez-Monzo et al., (1998) hanno dimostrato che l’introduzione di mosti d’uva concentrati e di soluzioni acquose di pectine mediante VI in campioni di mela si è rivelata efficace nella riduzione del gocciolamento durante lo scongelamento. Xie & Zhao (2003) hanno mostrato che l’impregnazione sottovuoto di fragole e more con soluzioni crioprotettrici (HCFS e pectina ad alto metile) arricchite col 7,5% di gluconato di calcio ne hanno migliorato molto la consistenza (aumentando la forza di compressione in un range del 50-100%) e hanno portato ad un’importante riduzione del gocciolamento (tra il 20-50%) su campioni congelati-scongelati. Inoltre, la riduzione del contenuto di acqua ottenuta mediante preliminare VI riduce a sua volta il consumo di energia durante la fase successiva di congelamento.
In tempi più recenti, sono stati studiati i trattamenti di VI per introdurre negli spazi vuoti degli alimenti ingredienti nutrizionali e funzionali, per far fronte alla crescente richiesta del mercato di prodotti di questo tipo. I risultati scientifici riguardo a questa applicazione della VI sono ancora limitati. Fito et al., (2001) sono stati i primi a valutare l’impiego della VI per ottenere innovativi alimenti funzionali freschi. Durante i loro esperimenti gli autori hanno studiato l’impregnazione di diverse verdure con soluzioni acquose di sali di calcio e ferro. Gras et al. (2003) hanno studiato l’applicazione della VI per l’ottenimento di melanzane, carote e funghi (Pleurotus ostreatus) fortificati con sali di calcio. Gli autori hanno valutato che melanzane e funghi possono essere considerati più adatti al trattamento di VI in virtù della loro elevata porosità in confronto alle carote. In un’altra serie di esperimenti, Xie & Zhao (2003) hanno usato la VI per arricchire mele, fragole e more con calcio e zinco. Gli esperimenti eseguiti con una soluzione concentrata di sciroppo di mais contenente calcio e zinco, hanno mostrato un buon livello di arricchimento a seguito di impregnazione (si raggiunge circa il 15-20% del RDI del calcio con l’assunzione di 200 g di mela fresca impregnata).
19 La VI può essere anche impiegata per produrre una numerosa serie di innovativi alimenti probiotici vista l’importanza e l’interesse crescente nei confronti di tali prodotti. Per esempio, Betoret et al., (2003) hanno studiato l’uso della VI per ottenere frutta secca arricchita con probiotici eseguendo dei trattamenti di impregnazione sottovuoto su campioni di mela con succo di mela e latte intero contenenti rispettivamente Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus casei ad una concentrazione di 107 - 108 cfu / ml (cfu= unità
formanti colonie). I risultati hanno permesso di affermare che, combinando VI ed essiccamento con aria a bassa temperatura, era possibile ottenere mele essiccate con un contenuto microbico di 106 - 107 cfu / g.
Sebbene l’impregnazione sottovuoto sia stata proposta per la prima volta almeno 20 anni fa, può essere ancora considerata una tecnologia emergente con elevate potenziali applicazioni nel settore alimentare, giocando un ruolo decisivo nell’introduzione di nuovi alimenti che possano rispondere all’aumentata aspettativa di vita.
1.1.5 La carenza di ferro: un problema clinico, sociale e di politica
sanitaria
La carenza nutrizionale di ferro è il disordine nutrizionale più comune e diffuso nel mondo, sia nei paesi industrializzati che non industrializzati. Si stima ne siano affette circa 2 milioni di persone, ed è uno dei principali fattori di rischio di disabilità e morte in tutto il mondo (Zimmermann & Hurrell, 2007).
La maggior parte del ferro presente nel corpo umano si trova a livello degli eritrociti come emoglobina, e la sua funzione principale è quella di trasportare l’ossigeno dai polmoni ai tessuti. Il ferro è anche un componente importante di vari sistemi enzimatici, come i citocromi, che sono coinvolti nel metabolismo ossidativo e viene immagazzinato nel fegato sotto forma di ferritina ed emosiderina (Allen, De Benoist, Dary, & Hurrell, 2006).
La carenza nutrizionale di ferro è il risultato di un bilancio negativo a lungo termine e nei suoi stadi più gravi provoca l’anemia che è definita come una bassa concentrazione di emoglobina nel sangue.
I valori soglia di emoglobina che indicano anemia variano con lo stato fisiologico (ad esempio età, sesso ecc.) e sono stati definiti per i vari gruppi di popolazione dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS).
L’anemia è considerata un problema di salute pubblica quando la frequenza di bassi valori di emoglobina è superiore al 5% della popolazione.
20
• Donne incinte, neonati e bambini dell’età di 1-2anni, 50%;
• Bambini in età scolare, 25%;
• Scolari, 40%;
• Adolescenti, 30-55%;
• Donne non incinte, 35%.
La carenza nutrizionale di ferro insorge quando i requisiti fisiologici non possono essere soddisfatti dall’assorbimento di ferro dalla dieta.
La biodisponibilità di ferro alimentare è bassa nelle popolazioni che consumano diete vegetariane con poca carne. Nella carne il 30-70% del ferro è ferro emico e di questo solo il 15-35% è assorbito. Invece, nelle diete vegetariane nei paesi sviluppati la maggior parte del ferro alimentare è ferro non emico, e il suo assorbimento è spesso sotto il 10%. L’assorbimento del ferro non emico è aumentato dalla carne e dall’acido ascorbico, ma inibito dai fitati, dai polifenoli e dal calcio. Poiché il ferro è presente in molti cibi e la sua assunzione è direttamente correlata all’energia assunta, il rischio di carenza è massimo quando le richieste di ferro sono maggiori rispetto al fabbisogno energetico.
L’alta frequenza di anemia da carenza di ferro nel mondo in via di sviluppo ha costi notevoli sia per la salute che economici. In un’analisi di 10 paesi in via di sviluppo, il valore mediano di perdite all’anno dovute a una diminuita produttività fisica da carenza di ferro è stato di circa 32$ a testa. Nella regione sub-africana l’OMS ha stimato che se la fortificazione di ferro avesse raggiunto il 50% della popolazione, si sarebbero evitati 570.000 casi di invalidità ogni anno. Durante i primi due trimestri di gravidanza, l’anemia da carenza di ferro aumenta il rischio di parto pretermine, basso peso alla nascita, mortalità infantile, ed è predittiva di una carenza di ferro nei bambini oltre i 4 mesi d’età. Si stima che l’anemia rappresenti rispettivamente il 3-7% e l’8-12% delle cause di morti materne durante la gravidanza e il parto in Africa e in Asia.
I dati relativi agli effetti negativi della carenza di ferro sullo sviluppo cognitivo e motorio nei bambini sono equivoci in quanto i fattori ambientali limitano la loro interpretazione. Diversi studi riportano effetti avversi dell’anemia da carenza di ferro sullo sviluppo nei bambini, effetti che potrebbero essere solo parzialmente reversibili. Altri studi suggeriscono che non esistono prove convincenti che l’anemia da carenza di ferro colpisca lo sviluppo mentale o motorio nei bambini di età inferiore ai 2 anni, ma piuttosto che la carenza di ferro influisca negativamente sulla “comprensione” nei bambini in età scolare. Scolaresche di anemici hanno mostrato una diminuzione dell’attività motoria e del rendimento scolastico. Inoltre, l’anemia sideropenica aumenta la suscettibilità alle infezioni, principalmente del tratto respiratorio superiore, le
21 quali si sono rivelate più frequenti e durature nei bambini anemici rispetto ai bambini sani.
1.1.5.1 Le strategie terapeutiche per contrastare la carenza di
ferro
Esistono diverse strategie, da sole o in combinazione, per correggere la carenza di ferro nella popolazione. Le principali sono:
• L’educazione alimentare, combinata con una modificazione dietetica o una diversificazione, o con entrambe, per migliorare l’assunzione di ferro e la sua biodisponibilità;
• L’integrazione di ferro (assunzione di ferro, di solito in dosi più elevate, indipendentemente dal cibo);
• L’arricchimento degli alimenti con ferro;
• La biofortificazione, tramite coltivazione di piante ricche di ferro ottenute mediante ingegneria genetica.
Sebbene la modificazione dietetica e la diversificazione della dieta siano gli approcci più sostenibili, il cambiamento delle pratiche e delle abitudini alimentari spesso risultano difficili, e gli alimenti che forniscono ferro altamente biodisponibile (come la carne ed altri prodotti di origine animale) sono costosi.
Studi recenti hanno segnalato come il corpo regoli l’assorbimento e il metabolismo del ferro in risposta al cambiamento dello status del ferro per sovraregolazione o down-regulation di proteine chiave, intestinali ed epatiche. Per tali ragioni, la supplementazione di ferro mirata, la fortificazione con ferro degli alimenti, o entrambe, possono essere una strategia vincente per contrastare la carenza di ferro nelle popolazioni a rischio.
L’allevamento selettivo di piante e l’ingegneria genetica sono nuovi approcci promettenti per migliorare la biodisponibilità di ferro nella dieta; tuttavia, una grande sfida è quella di dimostrare che questi metodi possono aumentare il contenuto di ferro a livelli nutrizionalmente utili e che il ferro assunto in questo modo è biodisponibile.
L’OMS ha definito le dosi giornaliere raccomandate di ferro (Recommended Daily Allowance, RDA) pari a 9 - 14 e 24 - 29 mg / giorno rispettivamente per uomini e donne di età superiore ai 18 anni, essendo il range relativo alla diversa biodisponibilità del ferro (WHO-FAO, 2001).
22 Le raccomandazioni sull'assunzione di ferro e altri nutrienti sono inoltre fornite nelle Dietary Reference Intakes (DRI) sviluppate dal Food and Nutrition Board (FNB) presso l'Institute of Medicine delle National Academies (IOM).
In Tabella 1sono riportate le attuali RDA di ferro per i non vegetariani. Le
RDA per i soggetti che seguono una dieta vegetariana sono invece 1,8 volte più alte di quelle per i soggetti che assumono alimenti di origine animale. Per i neonati fino ai 6 mesi d’età, l'FNB ha stabilito una dose adeguata di ferro equivalente all'ingestione media di ferro nei neonati allattati al seno. (National Institute of Health, 2016).
ETA’ UOMINI DONNE GRAVIDANZA ALLATTAMENTO
Dalla nascita a 6 mesi 0.27 mg 0.27 mg
7-12 mesi 11 mg 11 mg 1-3 anni 7 mg 7 mg 4-8 anni 10 mg 10 mg 9-13 anni 8 mg 8 mg 14-18 anni 11 mg 15 mg 27 mg 10 mg 19-50 anni 8 mg 18 mg 27 mg 9 mg 51+ anni 8 mg 8 mg
Tabella 1: Dosi giornaliere raccomandate (DGA) di ferro distinte per età, sesso e condizioni fisiologiche particolari quali gravidanza ed allattamento (National
23
1.1.5.2 La fortificazione degli alimenti con ferro
La fortificazione con ferro può essere un’effettiva strategia per il controllo della carenza nutrizionale di ferro a livello nazionale in quanto risulta essere una soluzione pratica, sostenibile e redditizia a lungo termine.
Tuttavia, a livello alimentare la fortificazione con ferro è più difficile rispetto a quella con altri nutrienti, come lo iodio nel sale e la vitamina A nell’olio da cucina. Infatti, i composti del ferro più biodisponibili sono solubili in acqua o acido diluito, ma spesso reagiscono con altri componenti alimentari e possono causare sapori sgradevoli, cambiamenti di colore, ossidazione dei grassi. Per queste ragioni, molto spesso per evitare cambiamenti sensoriali indesiderati si preferiscono forme meno solubili di ferro, anche se l’assorbimento risulta inferiore.
Nei paesi in cui il rischio di sviluppare carenza di ferro è elevato la fortificazione del ferro è generalmente raccomandata a tutta la popolazione per tutte le categorie, fatta esclusione per gli uomini adulti e le donne post-menopausa che sono identificati come i gruppi meno a rischio.
La tipologia di ferro e il tipo di fortificazione devono essere scelti sulla base del veicolo di fortificazione, dei fabbisogni di ferro della popolazione bersaglio e della biodisponibilità di ferro della dieta alimentare locale.
• Per la maggior parte degli alimenti (ad esempio: farine di cereali) si sono sin qui usati:
• Fe solfato;
• Fe fumarato;
• Solfato o fumarato ferrosi incapsulati;
• Fe elettrolitico (al doppio della quantità rispetto al solfato ferroso);
• FeNaEDTA.
• Per farine di cereali con alte quantità di fitati e salse con alte quantità di peptidi (es: pesce e salsa di soia):
• FeNaEDTA
• Per i prodotti lattiero-caseari liquidi:
• Fe biglicinato;
24
• Citrato ammonico ferrico.
Gli sviluppi nella fortificazione del ferro sono stati accelerati dalla Global Alliance for Improved Nutrition (GAIN), un’associazione di agenzie delle Nazioni Unite, governi nazionali, agenzie di sviluppo, e settore privato, finanziata principalmente dalla fondazione Bill & Melinda Gates. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi sulle conseguenze funzionali della carenza di ferro: ad esempio deve essere ancora chiarito l’effetto del livello di ferro sulla funzione immunitaria e cognitiva nei bambini e neonati. Inoltre, i progressi nella comprensione dei meccanismi molecolari che stanno alla base dell’assorbimento del ferro e del suo metabolismo potrebbero consentire lo sviluppo di nuove strategie per combattere una volta per tutte la carenza di ferro a livello mondiale.
1.1.6 Il FeNaEDTA quale fonte di Ferro per l’arricchimento degli
alimenti
Per l’arricchimento delle olive si è deciso di utilizzare come fonte di ferro il FeNaEDTA in quanto a parità di assorbimento rispetto ad altre fonti quali, ad esempio il FeSO4, non determina problemi di carattere organolettico sulla
matrice (variazioni indesiderate di colore, sapore, ecc…). Questo tipo di scelta è di fondamentale importanza soprattutto pensando all’introduzione in commercio dei prodotti così trattati; in questo caso, infatti, è importante che l’oliva mantenga le sue caratteristiche per una migliore accettazione da parte del consumatore.
Recentemente la Commissione Europea all’Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA), ha richiesto al gruppo di esperti scientifici sugli additivi alimentari e sulle fonti di nutrienti aggiunti agli alimenti (ANS) di fornire un parere scientifico sulla sicurezza del FeNaEDTA aggiunto per scopi nutrizionali ai prodotti alimentari (compresi gli integratori alimentari) e ai prodotti alimentari destinati ad un’alimentazione particolare (PARNUTS).
Questo parere riguarda esclusivamente la sicurezza del FeNaEDTA e la biodisponibilità di ferro da questa specifica fonte. La sicurezza del ferro in sé stesso, in termini di quantità che può essere consumata, era al di fuori del mandato del gruppo di esperti scientifici. Consultando gli studi sulla fortificazione condotti con il FeNaEDTA negli esseri umani, il gruppo di esperti scientifici ha dedotto che il ferro viene liberato dal complesso e risulta biodisponibile. Gli studi mostrano inoltre, che il ferro in forma di FeNaEDTA è da 2 a 3 volte più biodisponibile del ferro sotto forma di FeSO4 e che esso è
25 che l’assorbimento del FeNaEDTA è regolato in modo fisiologico dal contenuto corporeo di ferro, e la fortificazione degli alimenti con tale fonte di ferro non dovrebbe portare ad un sovraccarico di ferro nei soggetti ai quali viene somministrato.
Il FeNaEDTA è stato utilizzato in numerose prove in vivo relative alla fortificazione con ferro degli alimenti nei paesi in via di sviluppo e da questi studi non si sono evidenziati effetti avversi nelle persone sottoposti a prove di fortificazione con questo composto anche per un lungo periodo. Sulla base dei risultati sia in vitro che in vivo condotti sui topi, gli esperti dell’EFSA hanno affermato che non vi è alcun problema di sicurezza per quanto riguarda la genotossicità del FeNaEDTA se aggiunto per scopi nutrizionali a prodotti alimentari, in quanto questo presenta un bassissimo potenziale mutageno e solo a dosi estremamente elevate. Inoltre, il gruppo di esperti scientifici ha ritenuto che la potenziale formazione di formaldeide come prodotto di degradazione di EDTA non provochi problemi di sicurezza negli esseri umani, alle condizioni d’utilizzo proposte per il FeNaEDTA.
Successivamente, gli esperti hanno valutato le dosi ammissibili ed hanno stabilito che l’utilizzo di FeNaEDTA come fonte di ferro negli alimenti non crea problemi di sicurezza fintanto che non comporta un’esposizione all’EDTA superiore a 1,9 mg di EDTA/Kg peso corporeo/ giorno (European Food Safety Authority, 2010).
26
1.2 Scopo del lavoro
“Conoscere i prodotti della nostra terra è un’attività che mai si ripete offrendo, ogni qual volta, nuovi spunti, nuove riflessioni, nuovi apprezzamenti. Tra tutti sicuramente l’olio di Liguria è senza alcun dubbio quello più generoso di qualità e di segreti nascosti che riescono ad essere colti e svelati se ad esso ci si appresta con rispetto e attenzione…” (Barichello, Evangelisti, Pini, Rossi, & Zunin, 2002).
Questa è la prefazione della pubblicazione scientifica “L’olio di oliva ligure”, Quaderni di agricoltura, sponsorizzata dalla Regione Liguria e finanziata dall’Unione Europea, che ha dato lo spunto iniziale per intraprendere questo lavoro sperimentale sull’oliva quale prodotto tipico del nostro territorio, volto ad approfondire come l’impregnazione sottovuoto possa portare un reale contributo all’arricchimento con sostanze fisiologicamente utili.
Lo scopo del lavoro è stato proprio quello di dimostrare come questa tecnica innovativa e rapida, possa essere effettivamente d’aiuto nella realizzazione di alimenti funzionali destinati ad una specifica fetta di consumatori ossia i soggetti affetti da carenza di ferro. La necessità di avere a disposizione alimenti fortificati con ferro è ai giorni d’oggi sempre maggiore visto il costante ed importante aumento delle diete vegetariane e vegane in Italia e nel mondo.
Ottenere un prodotto che consenta di introdurre una quantità di ferro pari al fabbisogno giornaliero mediante l’assunzione di pochi frutti è stato il primo obiettivo di questo lavoro.
27
1.3 Parte sperimentale
1.3.1 Campioni
Olive da tavola verdi denocciolate in salamoia (cv. Hojiblanca) sono state acquistate sul mercato locale. I frutti sono stati dapprima sciacquati al fine di eliminare i residui di salamoia contenente acqua, cloruro di sodio, acido lattico e acido ascorbico. Successivamente, sono state tamponate su carta da filtro e tagliate longitudinalmente in due metà con l’ausilio di un bisturi chirurgico e posizionate all’interno di un beker pronto per essere inserito nella camera da vuoto (vedi Figura 5). Per ciascuna prova di impregnazione sono stati utilizzati 10 g di olive accuratamente pesati.
28
1.3.2 Reagenti chimici
Tutti i reagenti impiegati sono stati acquistati dalla ditta Sigma Chemicals (St. Louis, MO). L’acqua utilizzata in ciascuna preparazione proviene da un sistema Milli-Q® Millipore (Bedford, MA, USA). La vetreria di laboratorio
utilizzata è stata lavata, immersa in un bagno contenente HCl 1 M per 4 ore e successivamente sciacquata abbondantemente con acqua Milli-Q®.
1.3.2.1 Preparazione della soluzione estraente il ferro
Per l’estrazione del ferro è stata utilizzata una soluzione di idrossilamina cloridrato. Tale soluzione è stata preparata dapprima sciogliendo 7,5 g di idrossilammina cloridrato in pochi mL di H2O, aggiungendo successivamente 15
mL di HCl al 37% ed infine portando a volume con H2O in un matraccio tarato
da 100 mL. La soluzione è stata conservata a temperatura ambiente ed al riparo dalla luce fino al suo successivo utilizzo.
1.3.2.2 Preparazione della soluzione cromogena
Come cromogeno è stata utilizzata la 1,10-fenantrolina in quanto, tale molecola in presenza di un agente riducente è in grado di complessare il ferro e di produrre una caratteristica colorazione rossa.La soluzione del cromogeno è stata preparata sciogliendo 36 mg di 1,10-fenantrolina in 10-15 mL di H2O in un
matraccio tarato da 100 mL. La soluzione è stata sonicata e immersa in un bagno bollente, dopodiché, ad avvenuto raffreddamento, è stata portata a volume con sodio acetato 3M e refrigerata in vetro ambrato al fine di minimizzarne la degradazione catalizzata dalla luce.
1.3.3 Preparazione delle soluzioni di FeNaEDTA
Al fine di ottenere olive arricchite con ferro sono state preparate soluzioni acquose contenenti da 0,7 a 5,5 g di FeNaEDTA opportunamente diluiti in matraccio tarato da 1 L.
Per realizzare un’opportuna retta di calibrazione sono state preparate ed analizzate in duplicato soluzioni standard di FeNaEDTA aventi una concentrazione di ferro pari a 10, 5, 2.5, 2, 1 e 0.5 mg / 100 mL. Una soluzione standard primaria avente concentrazione pari a 50 mg Fe/100 mL è stata
29 preparata pesando accuratamente 370 mg di FeNaEDTA. Successivamente, dalla soluzione di partenza si sono ottenute per diluizione in H2O deionizzata le
soluzioni standard a diversa concentrazione di ferro.
1.3.4 Preparazione delle olive arricchite
Per le prove di impregnazione sottovuoto è stato utilizzato un essiccatore sotto vuoto modificato ad-hoc per il nostro laboratorio a partire dal modello in commercio “Sanplatec Vacuum Desiccator MB type” (Sanplatec Corp., Japan).
L’apparecchio consiste in una camera da vuoto realizzata in plexiglass di capacità pari a 15 L munita di una serie di valvole che permettono di portare a termine il processo di impregnazione (vedi Figura 6).
Figura 6: L’essiccatore sottovuoto utilizzato per l’impregnazione delle olive.
L’apparecchio è stato collegato ad una pompa da vuoto (Vacuubrand MZ2C) e grazie ad un regolatore di vuoto installato sull’essiccatore stesso, è stato possibile controllare la pressione interna alla camera.
L’operazione d’impregnazione è stata condotta dopo aver mantenuto sottovuoto nell’essiccatore a temperatura ambiente le olive per un tempo
30 definito (t1) prima di procedere con l’aggiunta, attraverso la valvola superiore
della camera, della soluzione esterna contenente ferro.
Dopo aver lasciato il campione a contatto con la soluzione impregnante per un tempo altresì prestabilito (t2), le olive sono state accuratamente scolate,
lavate due volte con acqua milliQ®, tamponate su carta da filtro e introdotte in
una provetta di polipropilene per la successiva analisi.
1.3.5 Determinazione del contenuto di ferro delle olive arricchite
Le olive impregnate, dopo l’aggiunta di 50 mL di H2O milliQ®, sono state
omogeneizzate utilizzando un Ultra-turrax T25 per 12 minuti a velocità 8000 rpm e successivamente centrifugate a 3500 rpm per 30 minuti.
La determinazione del ferro nella soluzione limpida ottenuta (S1), è stata
effettuata sfruttando un metodo colorimetrico che sfrutta come soluzione estraente una soluzione di idrossilammina cloridrato e come cromogeno una soluzione di 1,10-fenantrolina (Kosse J.S. & Yeung A.C., 2001). In particolare, 5 mL di soluzione limpida del campione (S1) sono stati miscelati con 10 mL della
soluzione estraente in provetta di vetro agitando con vortex 30 secondi (S2). 1
mL di S2 è stato addizionato a 5 mL di soluzione cromogena e dopo 15 minuti di
riposo al buio è stata registrata l’assorbanza a 510 nm contro un bianco preparato in maniera analoga ma senza l’aggiunta del campione (5 mL di acetato di sodio e 1 mL di H2O milliQ®).
1.3.6 Analisi Spettrofotometrica Uv-Vis
L’analisi spettrofotometrica è stata condotta utilizzando lo spettrofotometro Agilent 8453 per l’acquisizione dell’assorbanza a 510 nm. Sono state utilizzate cuvette di quarzo aventi cammino ottico pari ad 1 centimetro ed è stata utilizzata come bianco H2O milliQ®.
1.3.7 Disegno sperimentale e analisi statistica
È stato utilizzato il disegno sperimentale per evidenziare le variabili che significativamente influenzavano l’impregnazione delle olive e ottimizzare il processo, valutare le loro possibili interazioni ed ottenere livelli di fortificazione di ferro interessanti per la produzione industriale di olive fortificate.
31 Il disegno sperimentale e l’analisi statisticasono stati condotti utilizzando un software chemiometrico basato su R (Società Chimica Italiana - Group of Chemometrics, 2018).
32
1.4 Risultati e Discussione
I risultati di questo lavoro sperimentale volto all’arricchimento di una matrice alimentare quale le olive con il ferro, sono stati l’oggetto di una pubblicazione scientifica sulla rivista Journal of Food Science and Technology (2017), dal titolo:
“Olive fruits and vacuum impregnation, an interesting combination for dietetic iron enrichment”, Paola Zunin, Federica Turrini, Riccardo Leardi, Raffaella Boggia.
Il disegno sperimentale è una tecnica analitica ampiamente utilizzata al fine di ottenere informazioni massime al costo minimo.
In questo lavoro, il disegno sperimentale è stato utilizzato per evidenziare le variabili che significativamente influenzavano l’impregnazione, ottimizzarle, valutare le loro possibili interazioni ed ottenere livelli di fortificazione di ferro sfruttabili per la produzione industriale di olive fortificate.
La quantità di ferro totale, espressa come mg di Fe / g oliva, è stata utilizzata come variabile di risposta nello studio del processo di VI.
Sulla base di test preliminari e dati di letteratura sono state evidenziate sette variabili che potevano avere un’influenza sull’impregnazione(vedi Tabella 2).
VARIABILI
X1 Pressione di vuoto
X2 Tempo sottovuoto prima dell'impregnazione
X3 Concentrazione di ferro della soluzione
X4 Velocità di aggiunta della soluzione
X5 Tempo di contatto a pressione atmosferica
X6 Pressione osmotica della soluzione impregnante
X7 Osmolarizzante
Tabella 2: Elenco delle variabili individuate per il loro possibile effetto sul processo di VI.
