LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Evelina Štarolytė
Šunų adenovirozių nustatymas polimerazės grandininės
reakcijos metodu
The detection of canine adenovirus infections by
means of polymerase chain reaction method
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: dr. Raimundas Lelešius
2 DARBAS ATLIKTAS LSMU VA MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS
INSTITUTE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Šunų adenovirozių nustatymas polimerazės grandininės reakcijos metodu“.
1. Yra atliktas mano paties.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
\
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS LSMU VA MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas)
vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
1. SANTRAUKA ... 4 2. SUMMARY ... 5 3. SANTRUMPOS ... 6 4. ĮVADAS ... 7 5. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9 5.1. Šunų adenovirusai ... 95.1.1. 1−ojo tipo šunų adenovirusai ... 10
5.1.2. 2−ojo tipo šunų adenovirusai ... 11
5.1.3. 2−ojo tipo šunų adenovirusų aktualumas veterinarijoje ... 12
5.2. Infekcinis tracheobronchitas ... 12
5.2.1. Infekcinio tracheobronchito sukėlėjai ... 12
5.2.2. Šunidžių kosulio patogenezė ... 13
5.2.3. Šunidžių kosulio klinikiniai simptomai, gydymas ... 14
5.3. Mišrios infekcijos ... 14
5.3.1. Šunų maras ... 14
5.3.2. Šunų parvovirusinis enteritas... 15
5.4. Adenovirusų laboratorinė diagnostika ... 16
5.5. Adenovirozių profilaktika... 16
6. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 18
6.1. Klinikiniai tyrimai ir mėginių rinkimas ... 19
6.2. Molekulinės biologijos metodai – polimerazės grandininė reakcija ... 20
6.2.1. DNR išskyrimas ... 20
6.2.2. 1−ojo ir 2−ojo tipo šunų adenovirusų nustatymas PGR metodu ... 21
4
1. SANTRAUKA
Šunų adenovirozių nustatymas polimerazės grandininės reakcijos metodu Evelina Štarolytė
Magistro baigiamasis darbas
Baigiamojo darbo tikslas − įvertinti šunų adenovirusų įtaką sveikatingumui ir paplitimą kliniškai sveikų ir sergančių šunų populiacijoje taikant klinikinius ir molekulinės biologijos metodus.
Magistro baigiamąjį darbą sudaro 43 lapai, juose yra pateiktos 4 lentelės, 14 paveikslų, panaudoti 79 literatūros šaltiniai.
Tiriamasis darbas buvo atliekamas 2016 − 2018 metais LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos instituto virusologijos laboratorijoje. Tyrimui buvo surinkti šunų (n=70) išmatų mėginiai − iš kliniškai sveikų (n=13) ir sergančių (n=57) šunų. Iki PGR tyrimo atlikimo mėginiai buvo užšaldyti ir laikyti −18˚C temperatūroje.
Atlikus PGR tyrimą sveikų šunų grupėje užsikrėtimas šunų adenovirusais nebuvo nustatytas. Sergančiųjų grupėje nustatyti 9 (15,8 proc.) teigiami atvejai CAV−2 atžvilgiu, o CAV−1 nenustatyti. Vakcinacijos, amžiaus, sezoniškumo ir pasireiškusių klinikinių simptomų įtaka CAV−2 užsikrėtimui nebuvo nustatyta. Papildomai ištyrus sergančiųjų grupę CPV atžvilgiu, nustatyti 28 (49,1 proc.) teigiami užsikrėtimo atvejai. Mišri infekcija (CAV−2 ir CPV) nustatyta 6 (10,5 proc.) mėginiuose, CAV−2 monoinfekcija − 3 (5,3 proc.). Nustatyta, kad adenovirusams patekus į vadą užsikrėtimo rizika ženkliai padidėja lyginant su atskirai laikomais šuniukais (p<0,01). Taip pat prieglaudos šunys buvo dažniau užsikrėtę CAV−2 (p>0,05) ir CPV (p<0,05) nei veislyno šunys. CAV−2 užsikrėtimas ligos baigčiai statistiškai reikšmingos įtakos neturėjo (p>0,05).
5
2. SUMMARY
The detection of canine adenovirus infections by means of polymerase chain reaction method Evelina Štarolytė
Master‘s Thesis
The object of this study was to establish canine adenoviruses and evaluate prevalence among sick and clinically healthy dogs by clinical and molecular biology-based methods and health effects.
The study consists of 43 pages, including 4 tables, 14 images, and 79 literature sources. The research was carried out in LUHS VA Microbiology and Virology Institute‘s laboratory at 2016-2018. Total of 70 dog feces samples were collected for the study. Sampled dogs were divided into two groups: clinically healthy (n=13) and with signs of Canine adenovirus (n=57). All collected samples were immediately frozen and kept -18˚C temperature until PCR assay.
Canine adenoviruses not detected in clinically healthy dogs group using PCR method. In clinically affected dogs group were detected 9 (15.8%) positive cases of Canine adenoviruses type 2, Canine adenoviruses type 1 were not detected. Vaccination, age, a season of the year and clinical signs were not consistent to be associated with CAV−2 prevalence. In addition, clinically affected dogs were examined for Canine parvovirus infection and 28 (49.1%) positive samples were detected. Concomitant infection (CAV−2 and CPV) was detected in 6 (12.3%) dogs with clinical signs. CAV−2 monoinfection was detected in 3 (5.3%) samples. The detection of CAV−2 was higher in common puppy offsprings (p<0.01). Also, shelter dogs were more frequently infected CAV−2 (p>0.05) and CPV(p<0.05) than kennel dogs. The CAV−2 infection did not have a statistically significant effect on dogs mortality (p>0.05).
6
3. SANTRUMPOS
Bp − bazinės poros nm − nanometras n − imties dydis DNR − deoksiribonukleorūgštis RNR − ribonukleorūgštisCAV− šunų adenovirusas (Canine adenovirus)
CAV−1 − 1−ojo tipo šunų adenovirusas (Canine adenovirus 1) CAV−2 − 2−ojo tipo šunų adenovirusas (Canine adenovirus 2) IŠH − infekcinis šunų hepatitas
PGR − polimerazė grandininė reakcija CNS − centrinė nervų sistema
ITB − infekcinis tracheobronchitas
CPIV − šunų paragripovirusas (Canine parainfluenza virus) CPV − šunų parvovirusas (Canine parvovirus)
CDV − šunų maro virusas (Canine distemper virus) CHV-1 − šunų herpes virusas 1 (Canine herpes virus 1)
CRCoV − šunų kvėpavimo sistemos koronavirusas (Canine respiratory coronavirus) CIV − šunų gripo virusas (Canine influenza virus)
7
4. ĮVADAS
Šunų adenovirusai (CAV) yra dviejų tipų: 1−ojo tipo (CAV−1) ir 2−ojo tipo (CAV−2). Šie virusai tarpusavyje skiriasi savo patogeniškumu, antigeniškumu, imunogeniškumu ir genetinėmis savybėmis (1). CAV−1 šunims sukelia infekcinį šunų hepatitą (IŠH), sunkią sisteminę ligą pasireiškiančią ūmiu nekrozuojančiu hemoraginiu hepatitu (2). IŠH atveju pasireiškia karščiavimas, anoreksija, pilvo skausmai, diarėja, ragenos edema, dar vadinama „mėlynąja akimi“ (3,4). CAV−2 yra vienas iš pagrindinių etiologinių veiksnių sukeliančių infekcinį tracheobronchitą (ITB), dar kitaip vadinamą šunidžių kosuliu (1). Pasireiškus CAV−2 infekcijai yra sukeliamas viršutinių kvėpavimo takų uždegimas, gyvūnas kosti, atsiranda serozinių išskyrų iš nosies, padidėja limfiniai mazgai (5,6). Be kvėpavimo sistemos pažeidimų, pasireiškia ir neurologiniai sutrikimai, enteritas (7,8).
Šunų adenovirozės plinta tiesioginio ir netiesioginio kontakto būdu, su seilėmis, išmatomis, šlapimu, kvėpavimo takų išskyromis (7,9). Inkubacinis periodas užsikrėtus CAV−1 siekia keturias − devynias dienas, priklausomai nuo patogeno patekimo būdo, o CAV−2 nuo keturių iki septynių dienų (4,10,11). CAV−1 infekcijos atvejais mirtingumas gali siekti 10 − 30 proc. (4).
Infekcijos pasireiškimui įtakos turi patogenų koncentracija laikymo vietoje, stresas bei imunitetas (12,13). Pagrindinė profilaktikos priemonė apsisaugoti nuo adenovirozių yra naujų ir sergančių gyvūnų karantinavimas, patalpų dezinfekcija bei šunų vakcinacija (14).
CAV dažnai diagnozuojami kartu su: šunų parvovirusais (CPV), šunų koronavirusais (CCV), šunų maro virusais (CDV) bei kitais kvėpavimo takų infekcijas sukeliančiais patogenais (15-17). LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute 2016 metais tiriant CPV infekuotus šunis buvo nustatytas papildomas užsikrėtimas šunų adenovirozėmis (18). Mūsų tyrimo metu pasireiškus šunų adenovirozių simptomams pirmą kartą užsikrėtimai CAV−2 buvo nustatyti kaip monoinfekcijos (be CPV).
8 Darbo tikslas: Įvertinti šunų adenovirusų įtaką sveikatingumui ir paplitimą kliniškai sveikų ir sergančių šunų populiacijoje taikant klinikinius ir molekulinės biologijos metodus.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti kliniškai sveikų ir sergančių šunų mėginių tyrimus PGR metodu CAV−1 ir CAV−2 atžvilgiu.
2. Nustatyti šunų adenovirusų paplitimą esant skirtingiems veiksniams (lytis, vakcinacija, amžius, sezoniškumas, klinikiniai simptomai).
3. Nustatyti šunų adenovirusų ir parvovirusų mono−, mišrių infekcijų paplitimą ir jų pasireiškimą esant skirtingoms laikymo sąlygoms.
9
5. LITERATŪROS APŽVALGA
5.1. Šunų adenovirusai
Adenovirusai atrasti ir pirmą kartą paminėti mokslinėje literatūroje 1953 metais (21). Šie virusai turi dvigubą DNR, kurią dengia 90 nm ikosaedro formos apvalkalas. Viruso genomas sudarytas 28 - 42 kbp (22). Adenovirusai priklauso Adenoviridae šeimai, kuri sudaryta iš penkių genčių: Mastadenovirus, Aviadenovirus, Atadenovirus, Siadenovirus, Ichtadenovirus (23).
Šunų adenovirusai (CAV) priklauso Mastadenovirus genčiai ir yra dviejų tipų: 1-ojo tipo Canine Adenovirus (CAV−1) ir 2-ojo tipo (CAV−2). Tarpusavyje virusų tipai skiriasi patogeniškumu, antigeniškumu, imunogeniškumu ir genetinėmis savybėmis (1,11). CAV−1 ir CAV−2 nukleotidų lygiu yra 75 proc. identiški, todėl norint tiksliai diferencijuoti patogenus reikia naudoti molekuline biologija pagrįstus tyrimus (19).
CAV sukelia susirgimus naminiams ir laukiniams gyvūnams, tokiems kaip šunys, kojotai, raudonosios lapės, vilkai, kiti mėsėdžiai bei jūros žinduoliai (2).
Didžiojoje Britanijoje buvo atliekami PGR tyrimai su raudonosiomis lapėmis ir 18,8 proc. atvejų nustatytas užsikrėtimas CAV−1, tuo tarpu CAV−2 nenustatytas. Tyrimo metu buvo padaryta išvada, kad CAV−1 infekcija šalyje yra endeminė laisvai gyvenančių lapių populiacijoje (24). Italijoje 2011 metais buvo rasti abiejų tipų šunų adenovirusai lapių populiacijoje tiriant PGR tyrimu išmatų ir vidaus organų (kepenų, inkstų) mėginius ir padaryta išvada, kad laukinė fauna yra vienas iš pagrindinių šių virusų plitimo šaltinių (20). Japonijoje buvo nustatyta, kad 2 proc. meškėnų yra serologiškai teigiami CAV−1 ir 6 proc. CAV−2 atžvilgiu. Tyrimo rezultatai leido daryti išvadą, kad meškėnai taip pat gali būti rezervuarinis šeimininkas bei dalyvauti adenovirusų perdavime (25). Vokietijoje 2017 metais buvo vertintas CAV−1 užsikrėtimas meškėnų ir lapių populiacijose realaus laiko PGR metodu. Meškėnų mėginiuose CAV−1 nebuvo nustatytas, o lapių tiriamojoje medžiagoje rasta 11 teigiamų atvejų iš 97 (26).
10 adenovirusai yra plačiai paplitę Europos šalių laukinėje faunoje, kuri yra pagrindinis virusų plitimo šaltinis (20).
CAV−1 infekcija seniau buvo vadinama lapių epizootiniu encefalitu ir pirmą kartą pastebėta šunims 1930− ais metais (4). CAV−1 šunims sukelia infekcinį šunų hepatitą (IŠH), sunkią sisteminę ligą pasireiškiančia ūmiu nekrozuojančiu hemoraginiu hepatitu (2). IŠH yra būdingas karščiavimas, anoreksija, pilvo skausmai, vėmimas, diarėja su kraujo priemaišomis. Tuo tarpu CAV−2 sukelia infekcinį laringotrachėjitą, kvėpavimo sutrikimus (11). Pirmą kartą šis tipas buvo atrastas 1961-ais metais ištyrus šuns mėginį, turinčio kvėpavimo takų ligų simptomus (4,13).
Daugumoje Europos šalių susirgimai adenovirusais yra reti dėl vykdomos vakcinacijos prieš adenovirozes, kuri apsaugo nuo 1−ojo ir 2−ojo tipo adenovirusų. Dažniausiai klinikiniai atvejai pasireiškia nevakcinuotiems šunims (26,31).
Šunų adenovirozės neretai baigiasi mirtimi, todėl patogeno paplitimas yra intensyviai tiriamas (1,19). Italijoje mokslininkas A.Balboni (1) atliko tyrimą siekiant išsiaiškinti CAV−1 ir CAV−2 paplitimą šunų populiacijoje. Penkių savaičių laikotarpyje buvo imami šlapimo ir išmatųmėginiai iš kliniškai sveikų ir sergančių šunų. Atlikus PGR tyrimą buvo nustatytas užsikrėtimas CAV−2 − 58,8 proc. atvejų, o CAV−1 − 7,8 proc. Atlikto tyrimo rezultatai leido daryti išvadą, kad adenovirusai šalyje yra plačiai paplitę.
5.1.1. 1−ojo tipo šunų adenovirusai
CAV−1 sukelia sisteminę ligą − IŠH, anksčiau vadintą lapių epizootiniu encefalitu (4). CAV−1 replikuojasi kraujagyslių endotelio ląstelėse bei hepatocituose, sukeldamas ūmų nekrohemoraginį hepatitą. IŠH atveju sunkesnė ligos eiga dažniausiai stebima jauniems šuniukams (4,32). CAV−1 perdavimas vyksta tiesioginio kontakto būdu arba netiesioginio - per infekuotų gyvūnų seiles, išmatas, šlapimą ar kvėpavimo takų sekretą (9,11). Kada patogenas patenka per os inkubacinis laikotarpis trunka nuo keturių iki šešių dienų. Užsikrėtus tiesioginio kontakto būdu - nuo šešių iki devynių dienų (4). Po užsikrėtimo su šlapimu adenovirusai yra platinami šešis- devynis mėnesius (9). Mirtingumas gali siekti 10 − 30 proc., tačiau ženkliai didėja esant papildomai šunų koronaviruso (CCV), šunų maro (CDV) ar parvovirusinei (CPV−2) infekcijai (4,33).
11
pasireiškia dėl imuninių kompleksų atsidėjimo praėjus 1 - 3 savaitėms po pasveikimo (4,10). Italijoje atlikto tyrimo metu šuniukams pasveikus po IŠH net šešiais atvejais iš devynių pasireiškė vienpusis arba dvipusis ragenos edema (1 pav.) (34).
1 pav. Bilateralinė ragenos edema (4)
Sergant IŠH yra skiriamas simptominis gydymas, o kaip prevencija taikoma vakcinacija.
Pasireiškus infekcijos protrūkiui, gyvūnai atskiriami ir atliekama patalpų dezinfekcija (10). 2016 metais M. Wong (35) atlikto tyrimo metu buvo analizuojami du infekcinio hepatito atvejai. Gyvūnai buvo vakcinuoti, tačiau pasireiškė staigi mirtis. Atlikus skrodimus abiem šunims buvo rasti patologiniai pakitimai būdingi IŠH: išdidėjusios kepenys, vienu atveju - tulžies pūslės edema. Atlikus PGR tyrimą buvo nustatytas užsikrėtimas CAV−1. Taip pat buvo tirta parvovirusinio enterito ir šunų maro atžvilgiu, tačiau infekcijų sukėlėjai nenustatyti. Atlikto tyrimo metu buvo patvirtinta, kad vakcinacija neužtikrino apsaugos nuo infekcinio hepatito dėl galimų CAV−1 ir CAV−2 rekombinacijų ar padidėjusio virulentiškumo (35).
5.1.2. 2−ojo tipo šunų adenovirusai
CAV−2 pirmą kartą buvo išskirtas 1961 metais iš šunų sergančių laringotrachėjitu (13). Pradžioje atrastas virusas buvo laikomas silpnai virulentiška CAV−1 paderme, tik vėliau jis pripažintas kaip atskiras prototipas − CAV−2 (4,13).
12 replikuojasi nosies, ryklės epitelinėse ląstelėse ir trachėjos taurinėse ląstelėse sukeldami viršutinių kvėpavimo takų pažeidimus (11). CAV−2 užsikrėtimas sąlygoja tonsilito, faringito, trachėjito ir bronchito pasireiškimą (5). Dažniausiai užsikrėtimo CAV−2 metu CNS nėra pažeidžiama, tačiau yra pasitaikę atvejų, kada pasireiškė neurologiniai sutrikimai esant adenovirozei (4). Austrijoje trys iš keturių šuniukų nuo 9 iki 11 savaičių, kuriems buvo nustatyta CAV−2 infekcija, buvo eutanazuoti, nes pasireiškė ne tik švelnūs kvėpavimo sistemos sutrikimai, bet ir sunkūs neurologiniai požymiai, tokie kaip apatija, nugaros skausmas, toniniai - kloniniai traukuliai (8).
5.1.3. 2−ojo tipo šunų adenovirusų aktualumas veterinarijoje
CAV−2 ir kitų patogenų sukeliama kvėpavimo takų infekcija yra plačiai paplitusi pasaulyje (7,36). Ši infekcija dar vadinama šunų infekcinių kvėpavimo ligų kompleksu ar infekciniu tracheobronchitu (ITB) (4,11). ITB pasireiškia vietose, kur yra laikomas didelis kiekis šunų, pavyzdžiui, prieglaudose, veisimo patalpose, šunų parodose, dresūros pamokose ar varžybose (3,37). Taip pat užsikrėtimas galimas, kai šunys ar jų savininkai lankosi veterinarijos klinikose, naminių gyvūnų dienos priežiūros centruose bei gyvūnų viešbučiuose (3). Infekcijos pasireiškimą lemia šunų imunitetas, stresas, patalpoje esanti patogenų koncentracija ir ekspozicijos laikas su patogenu (12,13).
5.2. Infekcinis tracheobronchitas
5.2.1. Infekcinio tracheobronchito sukėlėjaiITB − plačiai pasaulyje paplitusi infekcija, kurią sukelia keletas patogenų (38). Didžiojoje Britanijoje atlikto tyrimo metu susirgimas buvo nustatytas 66 proc. naminių ir prieglaudose laikomų šunų (6). Pasireiškus šunidžių kosuliui sukeliamas kosulys, serozinės, mukozinės išskyros iš nosies, dūsimas. Infekcija gali tęstis keletą savaičių ir pereiti į bronchopneumoniją. Mokslinėse publikacijose yra fiksuota atvejų, kada dėl ITB gyvūnas gaišo arba buvo eutanazuotas (6). Šunidžių kosulys dažniausiai sukeliamas vieno ar keletos sukėlėjų.
Pagrindiniai respiratorinio trakto ligų sukėlėjai yra: 2-ojo tipo šunų adenovirusai;
Šunų paragripo virusai (CPIV); Šunų maro virusai;
13 CPIV yra viengrandis RNR virusas, priklausantis Paramyxoviridae šeimai, Rebulavirus genčiai (31,41). Virusas dauginasi nosies, ryklės, gerklų, trachėjos ir bronchų gleivinės epitelinėse ląstelėse ir jas žaloja. Sukelia kosulį, tonzilitą, laringitą, trachėjitą. Jei nėra antrinės infekcijos, klinikiniai požymiai dažniausiai praeina spontaniškai per 6 − 14 dienų (31).
CDV − RNR virusas, kuris priklauso Paramyxoviridae šeimai, Morbillivirus genčiai. Laikomas vienu labiausiai užkrečiamu patogenu (42). Sukelia kvėpavimo, odos, kaulų ir neurologinius pakitimus (17). Kartu su B. bronchiseptica ir CPIV sukelia stiprius kvėpavimo takų pakitimus ir mirtį (31).
CHV−1 – priklauso Herpesviridae šeimai, Varicellovirus genčiai. Pirmą kartą identifikuotas 1965 metais (43). Jauniems šuniukams dažniausiai sukelia sunkią klinikinę būklę ar baigiasi mirtimi (iki 2 savaičių amžiaus). Suaugusiems dažniausiai pasireiškia subklinikinė forma (31). Stebimi oftalminiai, reprodukciniai, respiratoriniai ir neurologiniai pakitimai (44). CHV−1 yra užsikrėtę
39-93 proc. populiacijos šunų (45).
Bordetella bronchiseptica – gramneigiama bakterija, kuri yra viena iš daugelio patogenų sukeliančių ITB (46). Bakterija aptinkama viršutiniuose kvėpavimo takuose pas asimptominius, lengvus klinikinius simptomus (išskyros iš nosies, čiaudulys) turinčius pacientus ir sunkiai sergančius šunis (31). Nors šunidžių kosulys dažnai būna keleto patogenų sukelta infekcija, tačiau yra nustatyta, kad viena Bordetella bronchiseptica taip pat gali sukelti kvėpavimo takų ligas ir yra laikoma svarbiausiu šunidžių kosulio patogenu (47).
Nepaisant šių tradicinių patogenų, taip pat randama ir kitų respiratorinių agentų, tokių kaip: Canine respiratory coronavirus (CRCoV), kuris pirmą kartą buvo išskirtas 2003 metais ir yra aptinkamas įvairiose pasaulio šalyse. Canine influenza virus (CIV) buvo aptiktas 2004 metais Šiaurės Amerikoje ir sukelia sunkius kvėpavimo takų pakitimus. JAV daugelyje valstijų yra nustatytas endeminis viruso paplitimas, tačiau kitose šalyse endeminių vietovių nenustatyta (47). Taip pat svarbūs ITB patogenezėje neseniai aptikti bakteriniai patogenai Mycoplasma cynos, Streptococcus equi porūšis zooepidemicus ir virusai- a novel canine bocavirus bei pneumovirus (48-50). Visi šie patogenai buvo išskirti iš sergančių kvėpavimo takų ligomis bei asimptominių šunų kartu su kitais kvėpavimo takų virusais (49).
5.2.2. Šunidžių kosulio patogenezė
14 būdu. Bakterijos Bordetella ir Mycoplasma spp. yra perduodamos per viršutinius kvėpavimo takus, tuo tarpu S. zooepidemicus infekcijos perdavimas nėra aiškus (7).
Patogenai patenka į viršutinių kvėpavimo takų blakstienotąsias epitelines ląsteles, replikuodamiesi sutrikdo blakstienėlių judėjimą, sukelia ciliostazę, o vėliau ir jų sunykimą (51).
5.2.3. Šunidžių kosulio klinikiniai simptomai, gydymas
Infekcijos pradžioje šuo gali būti be simptomų ar turėti tik švelnius klinikinius požymius, kaip rinitas, sinusitas, trachėjitas, bronchitas ar jų kombinaciją. Vėliau pasireiškia nekrozinis trachėjitas, bronchitas, kai kuriais atvejais bronchiolitas ir pneumonija (52). Šunidžių kosulio patogenai infekuoja viršutinius kvėpavimo takus, kartu pažeisdami ir apatinius kvėpavimo takus.
Yra išskirtos dvi šunidžių kosulio formos: lengva ir sunki (53).
Lengva forma pasireiškia sausu kosuliu, žiaukčiojimu ir vėmimu (55, 56). Esant lengvai formai stebimos serozinės, gleivingos išskyros iš nosies, laringitas, balso stygų pabrinkimas. Dėl padidėjusio jautrumo įkvėpiamai oro srovei, fizinio krūvio metu gyvūnui yra sukeliamas kosulys. Pasireiškus trachėjitui kosulys gali būti sukeliamas ir liečiant pirštais kaklo sritį ar patempus stipriau už antkaklio. Esant padidėjusiai gleivių gamybai gyvūnas dažnai žiaukčioja, iškosi baltas putas. Gyvūnų šeimininkams šie požymiai asocijuojasi su vėmimu (31).
Sunki forma pasireiškia daug rečiau. Pastebimas karščiavimas, depresija, išsekimas, vėmimas, diarėja, stebima pneumonija, dūsimas, kai kuriais atvejais šunidžių kosulys baigiasi mirtimi (31,53,54).
Esant nekomplikuotai infekcinio tracheobronchito formai skiriamas gydymas gliukokortikoidais, bronchodiliatatoriais, kosuliui mažinti. Antimikrobinė terapija yra rekomenduojama esant komplikuotai formai, kada yra pažeisti apatiniai kvėpavimo takai (4).
5.3. Mišrios infekcijos
CAV dažnai yra randami kartu su kitais kvėpavimo takų ligas sukeliančiais virusais ir bakterijomis: Pasteurella pneumotropica, Bordetella bronchiseptica, CPIV, CRCoV bei kitais patogenais kaip CVP−2, CCV, CDV (15,16,49,55,56).
5.3.1. Šunų maras
15 (31). CDV buvo diagnozuotas su dažniausiai enterito požymius sukeliančiais virusais, tokiais kaip CPV, CAV−1 ir CAV−2 (17,58). 2018 metais Selwyn A. Headley (17) ir kitų mokslininkų atliktame tyrime buvo aiškinamasi 15 šuniukų gaišimo priežastis. Aštuoniais atvejais iš 15-os, buvo rastas CDV kartu su CAV−1 ar CAV−2. Dažniausi gaišusių šuniukų patologiniai pakitimai buvo
hemoraginis enteritas (n=8), hidrotoraksas (n=7), kepenų degeneracija (n=5), vienam šuniukui buvo pasireiškusi ragenos edema, dar kitaip vadinama „mėlynąja akimi“, kuri atsiranda 2 – 3 savaitės po CAV−1 infekcijos. Tyrimo metu užsikrėtimas tik vienu patogenu pasitaikė 3 atvejais, dvejais
patogenais – 3, trejais patogenais – 5 ir keturiais patogenais – 4 atvejais. Tyrimo metu gautais rezultatais buvo nustatytas 80 proc. (12/15 atvejų) šunų užsikrėtimas dvejais ir daugiau patogenų ir 60 proc. šunų trejetą ir daugiau patogenų. Remiantis rezultatais ir kitų mokslininkų tyrimais dažniausiai staigią jaunų šuniukų mirtį sukelia keletas patogenų, kurie pažeidžia daugiau nei vieną organų sistemą (17).
5.3.2. Šunų parvovirusinis enteritas
CPV – DNR virusas, priklausantis Parvoviridae šeimai, Parvovirus genčiai. Infekcijai būdinga sunki ligos forma, kuri pasireiškia naminiams ir prieglaudose laikomiems šunims. Parvovirusinis enteritas gali pasireikšti įvairaus amžiaus šunims, tačiau dažniausiai būdingas šešių savaičių - šešių mėnesių amžiaus šuniukams (59). Portugalijoje atlikto tyrimo metu nustatyta, kad jaunesni šunys 12 kartų dažniau buvo infekuoti CPV nei vyresni šunys (p<0,01) (60). CPV plinta fekaliniu - oraliniu būdu, kontaktuojant su užkrėstomis išmatomis ar kontaminuota aplinka (59). CPV patekęs į organizmą atakuoja žarnyno kriptas, limfoidinį audinį, plinta į įvairius audinius, įskaitant smegenis (61,62). Infekcija pasireiškia sunkiu enteritu, vėmimu, kraujinga diarėja, apetito netekimu, depresija, svorio kritimu, karščiavimu ir dehidratacija (59). Persirgus būdingas miokardito išsivystymas (59,63). Infekcija diagnozuojama visų veislių šunims, nors nustatyta, kad mišrūnai yra mažiau jautrūs infekcijai nei rotveileriai, dobermano pinčeriai, amerikiečių pitbulterjerai ir vokiečių aviganiai (59,64). Parvovirusinis enteritas yra siejamas su labai dideliu sergamumu, mirtingumu bei mažu išgyvenamumu negydomiems šunims (65).
CPV užsikrėtimas yra diagnozuojamas kartu su CDV, CAV–2 ir CCV (17,66). Anksčiau minėtame Selwyn A. Headley (17) moksliniam tyrime šunims sergant maru (CDV) ir parvovirusiniu enteritu, dar papildomas užsikrėtimas CAV-1 buvo nustatyta 26,7 proc., o CAV-2 40 proc. tirtų šunų (17).
16
5.4. Adenovirusų laboratorinė diagnostika
Šunų adenovirusų tipą nėra sunku diferencijuoti esant būdingiems klinikiniams simptomas. Tačiau yra pastebėta atvejų, kai CAV–2 pažeidžia ne tik kvėpavimo takus, bet ir žarnyną, vieną iš pagrindinių 1-ojo tipo viruso pažeidžiamų sistemų. Tai reikalauja tikslesnės adenovirozių diferenciacijos (67).
Pagrindiniai morfologinio kraujo tyrimo rezultatų pakitimai esant adenovirozėms - limfopenija ir neutropenija (68). Esant infekciniam hepatitui galimi papildomi kraujo tyrimo rezultatų pakitimai (pvz.: sulėtėjęs krešėjimo laikas, padidėjusi alanino aminotransferazė ir aspartato aminotransferazė). Dažniausiai transaminazių padidėjimas stebimas tik pas sunkiai sergančius ar mirštančius šunis (4).
Pomirtiniai organų pakitimai ar histopatologinis tyrimas naudingas norint patvirtinti, diagnozuoti IŠH ar ITB. Dauguma atvejų ITB sukelia nekrozuojantį tracheobronchitą su eozonofiliniais branduoliniais intarpais epitelinėse ląstelėse (8). Remiantis Pietų Korėjos mokslininkų tyrimų rezultatais histopatologinio tyrimo jautrumas nustatant CAV–2 buvo 3/7 (42,9 proc.), o specifiškumas 206/206 (100 proc.) (69).
CAV–1 ir CAV–2 nustatyti galima virusų išskyrimo metodu, hemagliutinacijos, imunohistocheminiu tyrimu ir PGR metodu (8,67,69). Vienas iš pagrindinių diagnostikos metodų nustatyti adenovirusų tipams yra PGR. Nustatant užtenka tik vienos pradmenų poros tiek CAV–1, tiek CAV–2. Virusai yra identifikuojami pagal produkto dydį. CAV–1 dydis 508 bp, o CAV–2 – 1030 bp (67,69). Atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, kad PGR jautrumas siekia 100 proc., o specifiškumas 90,3 proc. (69). Nustatant adenovirozes patologinė medžiaga tyrimams gali būti nosies ir akių sekretas, išmatos, šlapimas (4,70). PGR jautrumas nustatant DNR virusą šlapime yra 10 kartų mažesnis lyginant su nustatymu išmatose (68).
5.5. Adenovirozių profilaktika
Pagrindinė profilaktikos priemonė yra naujų ir sergančių gyvūnų karantinavimas, atskyrimas, patalpų dezinfekcija, monovalenčių, polivalenčių vakcinų naudojimas (14).
18
6. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
Tiriamasis darbas vykdytas 2016 − 2018 metais. Laboratoriniai tyrimai atlikti LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos instituto virusologijos laboratorijoje. Šunų adenovirozių nustatymui naudota 2 pav. pavaizduota tyrimo schema.
19 Šunų adenovirozių užsikrėtimui nustatyti buvo surinkta 70 šunų išmatų mėginių. Išmatų mėginiai buvo surinkti iš 57 šunų, turinčių adenovirozėms būdingus klinikinius simptomus, ir 13-os kliniškai sveikų šunų. Šunų mėginiai buvo renkami 2016 − 2018 metais veterinarijos klinikose Kaune ir Jonavoje. Mėginiai buvo surenkami vatos tamponėlių pagalba imant išmatų mėginį iš tiesiosios žarnos ir sumaišius su fosfatiniu buferiniu tirpalu laikomi šaldiklyje (−18°C temperatūroje) iki tyrimo pradžios.
Šunų mėginiai buvo renkami gavus šeimininko leidimą ir atsižvelgus į klinikinius simptomus, įtariamą ligą, lankymosi klinikoje tikslą. Paimti mėginiai buvo sunumeruojami ir fiksuojami duomenys apie gyvūną: veislė, lytis, spalva, amžius, vakcinacija, svoris, kūno temperatūra, klinikiniai simptomai, gydymo trukmė, laikymo sąlygos, vada, kontaktas su kitais gyvūnais.
6.1. Klinikiniai tyrimai ir mėginių rinkimas
Prieš imant išmatų mėginius, norint nustatyti šunų adenovirozę, buvo įvertinama gyvūno klinikinė būklė. Pirmiausia fiksuojama informacija apie gyvūną, surenkama anamnezė. Atliekamas bendrasis klinikinis tyrimas norint įvertinti gyvūno sergamumą (gleivinių apžiūra, širdies, kvėpavimo darbas, temperatūra, odos elastingumas, limfinių mazgų apčiuopa).
20
1 lentelė. Sergančių šunų skaičius pagal klinikinius simptomus
Klinikiniai simptomai Gyvūnų skaičius
Karščiavimas (apie 40˚C) 13 Vėmimas 23 Viduriavimas 37 Gelta 2 Leukopenija 3 Skausmingas pilvas 31 Apatija 44 Kosulys 13 Žiaukčiojimas 4
Išskyros iš nosies, akių 7
6.2. Molekulinės biologijos metodai − polimerazės grandininė reakcija
6.2.1. DNR išskyrimasSurinkti šunų fekalijų mėginiai buvo atšildomi kambario temperatūroje ir elektronine maišykle sumaišomi 3 tūkst. aps./min. greičiu. DNR išskyrimui naudotas – GeneJET Genomic DNA Purification Kit rinkinys (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva. Kat. nr. K0721,). Vadovaujantis gamintojo nurodytomis instrukcijomis DNR išskyrimui pritaikytas A protokolas.
21 dalis dedama į 2 ml naują surenkamąjį mėgintuvėlį. Įpilama 500 μl praplovimui skirto 1-ojo buferinio tirpalo ir centrifuguojama 1 min. 8 tūkst. x g greičiu. Nusifiltravęs mišinys su surenkamuoju mėgintuvėliu yra išmetamas, o ant viršutinės dalies pilamas 2-asis buferinis tirpalas skirtas praplovimui. Centrifuguojama 3 min. 12 tūkst. x g greičiu. Viršutinė dalis perkeliama į naują mėgintuvėlį, įlašinama 100 μl specialaus DNR išplovimui iš filtro reikalingo buferinio tirpalo. Mėgintuvėliai 2 min. kambario temperatūroje yra inkubuojami ir vėliau centrifuguojami 1 min. 8 tūkst. x g greičiu. Išskirtas DNR ekstraktas naudojamas iškart PGR tyrimui arba yra užšaldomas.
6.2.2. 1−ojo ir 2−ojo tipo šunų adenovirusų nustatymas PGR metodu
CAV identifikuojami pagal susidariusį produkto dydį polimerazės grandinės reakcija. CAV−1 produkto dydis 508 bp, o CAV−2 – 1030 bp.
Identifikavimui naudojamas pradmuo HA1, kurio seka 5'−GCG GCT GAA CAT TAT TAC CTT GTC−3'. CAV−1 pozicija 770−791, CAV-2 pozicija 1387−1408.
Pradmens HA2 seka 5'−CCT AGA GCA CTT CGT GTC CGC TT−3'. CAV-1 pozicija 1274−1253, o CAV−2 2413−2392.
Pirmiausia buvo paruošiamas mišinys adenovirozių nustatymui. Mišinio sudėtis pateiktas 2 lentelėje. Paruošus mišinį, jis buvo perkeltas į PGR mėgintuvėlius.
2 lentelė. Adenovirozės nustatymui naudota mišinio sudėtis
Kiekis Medžiaga
30,5 μl vanduo be nukleazių (UAB,,Thermo Fisher Scientific Baltics”, Lietuva. Kat. nr. R0581);
5 μl PGR buferinio tirpalo (10 Mm Tris- HCl [Ph 8,3] 50 Mm KCl, 1,5 Mm MgCl2, UAB ,,Thermo Fisher Scientific Baltics”, Lietuva);
5 μl MgCl2 (25 mM), (UAB ,,Thermo Fisher Scientific Baltics”, Lietuva);
2 µl dNTP mix (2,5 mM kiekvieno, UAB ,,Thermo Fisher Scientific Baltics”, Lietuva);
20 pmol HA1 − 5'−GCG GCT GAA CAT TAT TAC CTT GTC−3';
20 pmol HA2 − 5'−CCT AGA GCA CTT CGT GTC CGC TT−3';
22 PGR atlikti naudota programa ir termocikleris “Eppendorf Mastercycler Personal”. PGR metu buvo atlikta pirminė denatūracija, 95°C temperatūroje ir kuri trunka 5 min. Po to vienas paskui kitą 35 ciklai − 94;58;72°C (sudaryti iš denatūracijos, hibridizacijos, grandinės ilginimo) ir galutinis grandinės ilginimas 72°C trunka 7 min. bei atvėsinimas iki 20°C.
Teigiama reakcija laikoma, kada atlikus elektroforezę ir apšvietus agarozės gelį UV spinduliais matomi susidarę produktai: 508 bp dydžio (CAV−1) ir 1030 bp (CAV−2).
6.3. Statistiniai metodai
23
7. REZULTATAI
Tyrimams šunų išmatų mėginiai buvo renkami Kauno ir Jonavos veterinarijos klinikose. Buvo tiriami sergantys ir kliniškai sveiki šunys. Sergančiais laikomi šunys turėję klinikinius simptomus būdingus šunų adenovirozėms, o kliniškai sveikais- be sveikatingumo problemų. Iš viso buvo surinkta 70 išmatų mėginių, iš kurių 57 (81,4 proc.) sergančių ir 13 (18,6 proc.) sveikų šunų.
Remiantis 3 lentelės duomenimis matome, kad sergančiųjų šunų tarpe buvo 82,5 proc. patinų ir 17,5 proc. patelių. Iš sergančių šunų 80,7 proc. šunų buvo vakcinuoti ir 19,3 proc. nevakcinuoti. Didžiąją dalį (80,7 proc.) šunų sudarė mišrūnai, o grynaveisliai − 19,3 proc.
Kliniškai sveikų šunų grupėjė buvo 61,5 proc. patinų ir 38,5 proc. patelių. Mišrūnai sudarė 53,8 proc., grynaveisliai − 46,2 proc. Sveikų šunų grupėje 46,2 proc. buvo vakcinuoti 53,8 proc. − nevakcinuoti. Surinkti mėginiai buvo tiriami PGR metodu nustatant CAV−1 ir CAV−2.
3 lentelė. Tirtų šunų skaičius pagal lytį, veislę, vakcinaciją
Požymiai
Gyvūnų skaičius
Iš viso Sergantys Kliniškai sveiki
24
3 pav. Kliniškai sveikų ir sergančių šunų užsikrėtimas 1−ojo ir 2−ojo tipo šunų adenovirusais
Atlikus PGR tyrimą, kliniškai sveikų šunų grupėje užsikrėtimas CAV−1 ir CAV−2 nebuvo nustatytas. Sergančiųjų grupėje nustatytas 15,8 proc. užsikrėtimas CAV−2, o CAV−1 nenustatytas (3 pav.).
25 Remiantis 4 pav. duomenimis matome, kad ištyrus sergančių šunų grupę − 47 patinus ir 10 patelių, atitinkamai nustatyti 8 ir 1 teigiami mėginiai. Patinų ir patelių užsikrėtimo CAV−2 procentinis skirtumas statistiškai nebuvo ženklus (p>0,05).
5 pav. Vakcinuotų ir nevakcinuotų šunų užsikrėtimas CAV-2
Iš 5 pav. pateiktų duomenų matome, kad nevakcinuoti šunys CAV−2 užsikrėtę buvo 8 atvejais iš 46, o vakcinuoti 1 atveju iš 11. Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad procentinis skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05).
26 Remiantis gautais duomenimis (6 pav.) matome, kad didžiausias sergamumas nustatytas 2 mėn. amžiaus šuniukams − 6 atvejai iš 17. Šunims virš 2 metų nustatytas 1 užsikrėtimo atvejis iš 4. Iki 1 mėn. amžiaus užsikrėtimas pasireiškė 1 iš 7 šuniukų. 3 mėn. amžiaus šuniukams 1 atveju iš 10. Nuo 4 mėn. iki 2 metų amžiaus šunims užsikrėtimas nenustatytas. Amžiaus įtaka užsikrėtimui CAV−2 nenustatyta (p>0,05).
7 pav. Sergančių šunų užsikrėtimas CAV−2 skirtingais metų laikais
27
8 pav. Užsikrėtusių CAV−2 šunų procentas pagal klinikinius simptomus
Remiantis gautais rezultatais (8 pav.) matome, kad virškinimo sistemos sutrikimus turintiems šunims CAV-2 buvo nustatytas 8 atvejais iš 46, o kvėpavimo sutrikimus 1 atveju iš 11. Tačiau atlikus statistinę analizę, pasireiškusių klinikinių simptomų įtaka užsikrėtimui CAV−2 nebuvo nustatyta (p>0,05).
4 lentelė. CAV−2 teigiamų šunų užsikrėtimas parvovirusiniu enteritu
Klinikiniai simptomai
PGR tyrimų rezultatai
Šunų parvovirusinis enteritas CAV−2
Vėmimas, karščiavimas Neigiamas Teigiamas
Viduriavimas, apatija Teigiamas Teigiamas
Viduriavimas, apatija,
karščiavimas Teigiamas Teigiamas
Viduriavimas, apatija Teigiamas Teigiamas
Vėmimas, karščiavimas Teigiamas Teigiamas
Vėmimas, viduriavimas, apatija Neigiamas Teigiamas
Vėmimas Neigiamas Teigiamas
Viduriavimas Teigiamas Teigiamas
28 Sergantys šunys užsikrėtę CAV−2 buvo papildomai tiriami parvovirusinio enterito atžvilgiu. Pagal lentelėje pateiktus duomenis, matome, kad 6 šunims (10,5 proc.) buvo nustatyta mišri infekcija (CAV−2 ir CPV), o 3 šunims (5,3 proc.) – CAV−2 monoinfekcija.
9 pav. Sergančių šunų užsikrėtimas CPV
Tiriant sergančių šunų grupę buvo nustatyti 28 parvoviroziųatvejai iš 57 (9 pav.).
10 pav. Trijų šuniukų vadų užsikrėtimas CAV−2 ir CPV
29
11 pav. Šunų atskirtų ir neatskirtų nuo vados procentinis užsikrėtimas CAV−2
Iš 11 paveikslo pateiktų duomenų matome, kad šunys (iki 4 mėn.) neatskirti nuo vados CAV−2 užsikrečia 6,3 kartus dažniau nei atskirti šunys (p<0,01). Atskirti nuo vados šunys CAV−2 buvo užsikrėtę 2 atvejais iš 23, neatskirti šunys 6 atvejais iš 11.
30 Remiantis 12 pav. duomenimis, matome, kad iš veislyno kilusiems šunims CAV−2 užsikrėtimas buvo nustatytas 1 atveju , o CPV – 3 atvejais iš 12. Šunims iš prieglaudos CAV−2 buvo nustatytas 8 atvejais, o CPV 25 atvejais iš 45. Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad laikymo sąlygų ir užsikrėtimo CPV procentinis skirtumas buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05). Tačiau laikymo sąlygų įtaka užsikrėtimui CAV−2 nebuvo nustatyta (p>0,05).
13 pav. Ligos baigtis monoinfekcijų ir mišrių infekcijų atvejais
31
14 Pav. Monoinfekcijų atvejais pasireiškęs gaištamumas atsižvelgiant į amžių
32
8. REZULTATŲ APTARIMAS
Pasaulyje intensyviai plinta šunų adenovirozės ir užkrečia vis didesnį skaičių naminių šunų bei laisvėje gyvenančių gyvūnų (1,73). Lietuvos klinikinėje praktikoje adenovirozės yra nustatomos atsižvelgiant į klinikinius simptomus ir kraujo tyrimo rezultatus. Norint tiksliai nustatyti užsikrėtimus, reikalingi molekulinės biologijos tyrimai. Dėl šios priežasties nėra pakankamai informacijos apie šunų adenovirusų paplitimą Lietuvoje. Atsižvelgiant į esamą padėtį, buvo atliekami tyrimai PGR metodu nustatant šunų adenovirozes. Tyrimui atlikti šunų išmatų mėginiai buvo surinkti iš 57 šunų, turinčių adenovirozėms būdingus klinikinius simptomus, ir 13-os kliniškai sveikų šunų.
Mūsų atlikto tyrimo metu kliniškai sveiki šunys (n=13) nebuvo užsikrėtę adenovirozėmis. Mokslinėje literatūroje aprašyti įvairūs rezultatai tiriant sveikus šunis. Šiaurės Vokietijoje atlikto tyrimo metu sveikiems šunims buvo nustatytas 1,1 proc. užsikrėtimas CAV−2, JAV tyrimais − 12,5 proc. (47,49). Remiantis Naujosios Zelandijos moksliniu darbu atliktu 2018 metais buvo padaryta išvada, kad dažniausiai CAV−2 nustatoma sveikiems šunims (13 proc.) (74). Nevienodi mokslininkų rezultatai galimi dėl skirtingų šunų populiacijų, skirtingų mėginių ėmimo ir laikymo būdų (74). Taip pat įtakos rezultatams gali turėti nevienodos gyvūnų laikymo sąlygos, kontaktas su kitais gyvūnais bei taikytos skirtingos vakcinacijos programos.
Mūsų atlikto tyrimo metu šunims, kuriems pasireiškė klinikiniai simptomai būdingi adenovirozėms, CAV−1 užsikrėtimas nebuvo nustatytas. Tuo tarpu, CAV−2 nustatyti 9 atvejai (15,8 proc.). Lenkijoje atlikto tyrimo metu CAV−2 buvo nustatytas 10 proc. tirtų šunų, kurie turėjo klinikinius simptomus būdingus CAV (53). Italijoje 58,8 proc. CAV−2 užsikrėtusiems šunims buvo pasireiškę lengvi, vidutiniai arba sunkūs klinikiniai požymiai būdingi adenovirusams (1). Dažniausi CAV klinikiniai požymiai buvo viduriavimas, apatija, vėmimas, kosulys ir žiaukčiojimas (4,5).
Mūsų atlikto tyrimo metu užsikrėtimas CAV−2 priklausomai pagal lytį buvo dažnesnis (p>0,05) patinams (17,0 proc.) nei patelėms (10,0 proc.). Remiantis kitų mokslininkų tyrimais, statistiškai patikimas ryšys tarp lyties ir adenovirozių pasireiškimo taip pat nebuvo nustatytas (1).
33 Tirtoje sergančiųjų šunų grupėje CAV−2 užsikrėtimas dažniausiai buvo nustatytas 2 mėn. amžiaus šuniukams (35,3 proc.). Nuo 4 mėn. iki 2 metų amžiaus šunims užsikrėtimas nenustatytas. Tačiau užsikrėtusių CAV−2 skirtingo amžiaus šunų procentinis skirtumas nebuvo reikšmingas (p>0,05). Užsikrėtimas jaunesniame amžiuje gali būti siejamas su silpnu imunitetu, neatlikta vakcinacija. Yra aprašyta keletas tyrimų išsiskiriančių gautais rezultatais. Italijoje atlikto tyrimo metu amžius neturėjo įtakos užsikrėtimui adenovirusais (1). Kituose moksliniuose darbuose yra stebimas dažnesnis užsikrėtimas adenovirozėmis jaunesnio (<1m) ir vyresnio (>10m.) amžiaus šunims (31). Turkijoje atlikto tyrimo metu dažnesnis sergamumas buvo nustatytas vyresnio amžiaus (>1m) šunims (p<0,05) (11). Skirtingi tyrimų rezultatai galimi dėl nevienodų imčių skaičiaus, gyvūnų laikymo sąlygų, vakcinacijos schemų.
Mūsų atlikto tyrimo metu nustatyta, kad daugiausia užsikrėtimų CAV−2 buvo pavasarį (28,6 proc.), o vasarą užsikrėtimai nebuvo nustatyti. Tačiau atlikus statitinę analizę, sezoniškumo įtaka užsikrėtimui CAV−2 nebuvo nustatyta (p>0,05). Remiantis moksline literatūra šunidžių kosulys, kurį sukelia CAV−2 ir kiti patogenai, dažniausiai pasireiškia sezoniškai (7). Didžiausias sergamumas stebimas šaltuoju periodu, dėl nusilpusio imuniteto, žemos oro temperatūros (7,77).
Analizuojant tyrimą buvo nustatyta, kad kvėpavimo sistemos sutrikimus turintiems šunims CAV−2 nustatytas 9,1 proc. atvejų, o virškinimo sistemos sutrikimus turintiems šunims 17,4 proc. (p>0,05). A. Balboni (1) atlikto tyrimo metu, šunims pasireiškus virškinimo sistemos sutrikimams CAV−2 nustatytas 83,3 proc. atvejų, tuo tarpu kvėpavimo sistemos pažeidimų atvejais 100 proc. Nors CAV−2 yra laikomas patogenu sukeliančiu kvėpavimo sistemos pažeidimus, tačiau dažnai nustatomas esant virškinimo sistemos sutrikimams. Dėl šios priežasties virusas intensyviai plinta per išmatas, ypač patalpose, kur nėra griežtai laikomasi sanitarijos (1,7).
Tyrimo metu užsikrėtę CAV−2 ir turėję enteritui būdingus klinikinius simptomus, papildomai buvo tiriami PGR metodu šunų parvovirusinio enterito atžvilgiu. Remiantis gautais duomenimis, buvo nustatyti 6 atvejai (10,5 proc.) šunų sergančių mišria infekcija (CPV ir CAV−2). Moksliniuose tyrimuose šunų adenovirusai dažnai diagnozuojami mišrių infekcijų atvejais, kartu su CDV, CPV, CPIV (16,39). Dažniausiai mišria infekcija serga šunys, kurie laikomi prastomis sąlygomis, prieglaudoje ir yra maitinami nepilnaverčiu pašaru (39). Dažnas mišrios infekcijos pasireiškimas taip pat gali būti siejamas su nusilpusiu imunitetu, dėl kurio patekus vienam virusui palengvinamas kito viruso patekimas (1). Kinijoje atlikto tyrimo metu buvo tiriami enterito požymius turintys šunys. CAV užsikrėtimas, kaip monoinfekcija, nebuvo nustatytas. Adenovirozės buvo nustatytos vienu atveju kartu su CPV (1,6 proc.) ir trimis atvejais, esant 3 patogenams (CAV, CPV ir CCV) (3,6 proc.) (78).
34 infekcijos pasireiškimą sukelia keletas sukelėjų (39,40). Esant ITB simptomams monoinfekcija buvo diagnozuota Naujojoje Zelandijoje 28 proc. tirtų šunų, o Japonijoje 29 proc. šunų (5,74).
Taip pat mūsų darbe buvo tiriama visa sergančiųjų grupė CPV atžvilgiu ir nustatyti 28 (49,1 proc.) teigiami atvejai. Portugalijoje atlikto tyrimo metu CPV užsikrėtimas enterito požymius turintiems šunims buvo nustatytas 77,5 proc. atvejų. Taip pat ištirta, kad CPV infekcija 12 kartų dažniau pasireiškia jauniems šuniukams (p<0,001) (60). Brazilijoje atlikto tyrimo metu pasireiškus diarėjai CPV buvo nustatytas 54,3 proc., o CAV – 4,9 proc. atvejų (79). Skirtingi tyrimų rezultatai galimi dėl skirtingų laikymo sąlygų, patalpų sanitarijos ar skirtingų vakcinacijos schemų.
Atliekant tyrimą buvo analizuojamos 3 vados, kurioms pasireiškė adenovirozių klinikiniai simptomai. Visose vadose buvo diagnozuotas CAV−2 kartu su CPV, tačiau 100 proc. vados šuniukų užsikrėtimas buvo nustatytas tik dviejose vadose. CPV nustatytas visose vadose ir tik 1 atveju nustatyta kaip monoinfekcija. Vados šuniukai laikomi kartu buvo infekuoti 6,3 kartų dažniau CAV−2 nei atskirai laikomi šunys (p<0,01). Infekcijos pasireiškimui įtaką daro patogenų koncentracija bei gyvūnų imunitetas, todėl infekcijos pasireiškimo rizika vadoje, kada yra bent vienas infekuotas gyvūnas, stipriai padidėja (3,12).
Mūsų darbe buvo nagrinėjama ar laikymo sąlygos lemia infekcijų pasireiškimą. Veislyno šunų grupė buvo sudaryta iš 12 tiriamųjų ir joje nustatytas 1 atvejis (8,3 proc.) užsikrėtimo CAV−2 ir 3 atvejai (25,0 proc.) CPV. Kitą tiriamąją grupę iš prieglaudos kilusių šunų sudarė 45 tiriamieji. Iš jų 25 mėginiuose (55,6 proc.) nustatytas CPV ir 8 (17,8 proc.) CAV−2. Atlikus statistinę analizę, nustatytas statistiškai patikimas ryšys tarp laikymo sąlygų ir užsikrėtimo CPV (p<0,05), tačiau CAV-2 nenustatytas (p>0,05). Remiantis mokslinių tyrimų duomenimis, aukšta užsikrėtimo rizika prieglaudose laikomiems šunims yra dėl didelio skaičiaus šunų, streso lygio ir imuniteto trūkumo (3,12). JAV atliktais tyrimais prieglaudose CAV−2 užsikrėtimas buvo diagnozuojamas 12,5 proc., Brazilijoje 9 proc. tirtų šunų (39,49).
35
9. IŠVADOS
1. Ištyrus PGR metodu šunų išmatų mėginius nustatyta, kad kliniškai sveiki šunys (n=13) nebuvo užsikrėtę CAV, o sergantys šunys (n=57) buvo užsikrėtę CAV−2 (15,8 proc.). CAV−1 užsikrėtę šunys nebuvo nustatyti.
2. Lyties, vakcinacijos, amžiaus, sezoniškumo ir pasireiškusių klinikinių požymių įtaka užsikrėtimui šunų adenovirusais nebuvo nustatyta (p>0,05). Sergančių šunų grupėje užsikrėtimas CAV−2 patinams buvo nustatytas 17,0 proc., o patelėms – 10,0 proc. Nevakcinuoti šunys buvo užsikrėtę 17,4 proc., o vakcinuoti – 9,1 proc. atvejų. Dažniausias sergamumas nustatytas 2 mėn. amžiaus šuniukams (35,3 proc.). Sergantys šunys dažniausiai buvo užsikrėtę pavasarį (28,6 proc.). Šunims turintiems virškinimo sistemos sutrikimus užsikrėtimas CAV−2 buvo nustatomas 17,4 proc., o kvėpavimo sutrikimus– 9,1 proc. atvejų.
3. Sergančių šunų grupėje nustatytas 10,5 proc. užsikrėtimas mišria CAV−2 ir CPV infekcija, o CAV−2 ir CPV monoinfekcijomis – 5,3 proc. ir 38,6 proc. Vados šuniukai buvo infekuoti CAV−2 6,3 kartų dažniau (54,6 proc. ir 8,3 proc.) nei atskirai laikomi šunys (p<0,01). Prieglaudos šunims (17,7 proc.) dažnesnė užsikrėtimo CAV−2 rizika nebuvo nustatyta lyginant su veislyno šunimis (8,3 proc.) (p>0,05), skirtingai nei CPV atveju (55,6 proc. ir 25,0 proc.) (p<0,05).
36
10.
PADĖKA
Noriu nuoširdžiai padėkoti darbo vadovui dr. R. Lelešiui už kantrybę, žinias, patarimus, pastebėjimus ir suteiktą laiką atliekant magistro baigiamąjį darbą. Dėkoju už galimybę atlikti tyrimą LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos instituto virusologijos laboratorijoje, labiau susipažinti su PGR metodu.
37
11.
LITERATŪROS ŠALTINIAI
(1) Balboni A, Mollace C, Giunti M, Dondi F, Prosperi S, Battilani M. Investigation of the presence of canine adenovirus (CAdV) in owned dogs in Northern Italy. Res Vet Sci 2014 Dec;97(3):631-636.
(2) Balboni A, Dondi F, Prosperi S, Battilani M. Development of a SYBR Green real-time PCR assay with melting curve analysis for simultaneous detection and differentiation of canine adenovirus type 1 and type 2. Journal of Virological Methods 2015 15 September 2015;222:34-40. (3) Sykes JE. Canine Viral Respiratory Infections. In: Sykes JE, editor. Canine and Feline Infectious Diseases Saint Louis: W.B. Saunders; 2014. p. 170-181.
(4) Decaro N, Martella V, Buonavoglia C. Canine adenoviruses and herpesvirus. Vet Clin North Am Small Anim Pract 2008 Jul;38(4):799-814, VIII.
(5) Mochizuki M, Yachi A, Ohshima T, Ohuchi A, Ishida T. Etiologic study of upper respiratory infections of household dogs. J Vet Med Sci 2008 Jun;70(6):563-569.
(6) Mitchell JA, Cardwell JM, Leach H, Walker CA, Le Poder S, Decaro N, et al. European surveillance of emerging pathogens associated with canine infectious respiratory disease. Vet Microbiol 2017 Dec;212:31-38.
(7) Buonavoglia C, Martella V. Canine respiratory viruses. Vet Res 2007 Mar-Apr;38(2):355-373. (8) Benetka V, Weissenbock H, Kudielka I, Pallan C, Rothmuller G, Mostl K. Canine adenovirus type 2 infection in four puppies with neurological signs. Vet Rec 2006 Jan 21;158(3):91-94.
(9) Poppensiek GC, Baker JA. Persistence of Virus in Urine as Factor in Spread of Infectious Hepatitis in Dogs. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1951 06/01; 2018/06;77(2):279-281.
(10) Sykes JE. Infectious Canine Hepatitis. In: Sykes JE, editor. Canine and Feline Infectious Diseases Saint Louis: W.B. Saunders; 2014. p. 182-186.
(11) Bulut O, Yapici O, Avci O, Simsek A, Atli K, Dik I, et al. The Serological and Virological Investigation of Canine Adenovirus Infection on the Dogs. The Scientific World Journal 2013;2013:6.
38 (13) Ditchfield J, Macpherson LW, Zbitnew A. Association of Canine Adenovirus (Toronto A 26/61) with an Outbreak of Laryngotracheitis (Kennel Cough): A Preliminary Report. The Canadian Veterinary Journal 1962 08;3(8):238-247.
(14) Mitchell JA, Brownlie J. The challenges in developing effective canine infectious respiratory disease vaccines. J Pharm Pharmacol 2015 Mar;67(3):372-381.
(15) Pratelli A, Martella V, Elia G, Tempesta M, Guarda F, Capucchio MT, et al. Severe enteric disease in an animal shelter associated with dual infections by canine adenovirus type 1 and canine coronavirus. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 2001 Jun;48(5):385-392.
(16) Headley SA, Alfieri AA, Fritzen JT, Garcia JL, Weissenbock H, da Silva AP, et al. Concomitant canine distemper, infectious canine hepatitis, canine parvoviral enteritis, canine infectious tracheobronchitis, and toxoplasmosis in a puppy. J Vet Diagn Invest 2013 Jan;25(1):129-135.
(17) Headley SA, Oliveira TES, Pereira AHT, Moreira J, Michelazzo MMZ, Pires B, et al. Canine morbillivirus (canine distemper virus) with concomitant canine adenovirus, canine parvovirus-2, and Neospora caninum in puppies: a retrospective immunohistochemical study. Scientific Reports 2018 09/07;8(1):13477.
(18) V. Misiūnaitė. Šunų adenovirusų ir parvovirusų sukeliamų infekcinių ligų diagnostika naudojant polimerazės grandininę reakciją. Lietuva: LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS; 2016.
(19) Dowgier G, Mari V, Losurdo M, Larocca V, Colaianni ML, Cirone F, et al. A duplex real-time PCR assay based on TaqMan technology for simultaneous detection and differentiation of canine adenovirus types 1 and 2. J. Virol Methods 2016 Aug;234:1-6.
(20) Balboni A, Verin R, Morandi F, Poli A, Prosperi S, Battilani M. Molecular epidemiology of canine adenovirus type 1 and type 2 in free-ranging red foxes (Vulpes vulpes) in Italy. Vet Microbiol 2013 Mar 23;162(2-4):551-557.
(21) Ghebremedhin B. Human adenovirus: Viral pathogen with increasing importance. European journal of microbiology & immunology 2014 03;4(1):26-33.
(22) Junyent F, Kremer EJ. CAV-2—why a canine virus is a neurobiologist's best friend. Current Opinion in Pharmacology 2015 October 2015;24(Supplement C):86-93.
(23) Harrach B, Benko M, Both GW, Brown M, Davison AJ, Echavarra M, et al. Family Adenoviridae. ; 2011.
39 (25) Aoki E, Soma T, Yokoyama M, Matsubayashi M, Sasai K. Surveillance for Antibodies Against Six Canine Viruses in Wild Raccoons (Procyon Lotor) in Japan. J Wildl Dis 2017 Oct;53(4):761-768.
(26) Hechinger S, Scheffold S, Hamann HP, Zschock M. Detection of canine adenovirus 1 in red foxes ( Vulpes vulpes) and raccoons ( Procyon lotor) in Germany with a TaqMan real-time PCR assay. J Vet Diagn Invest 2017 Sep;29(5):741-746.
(27) Knowles S, Bodenstein BL, Hamon T, Saxton MW, Hall JS. Infectious Canine Hepatitis in a Brown Bear ( Ursus arctos horribilis) from Alaska, USA. J Wildl Dis 2018 July;54(3):642-645. (28) Garcia Marin JF, Royo LJ, Oleaga A, Gayo E, Alarcia O, Pinto D, et al. Canine adenovirus type 1 (CAdV-1) in free-ranging European brown bear (Ursus arctos arctos): A threat for Cantabrian population? Transbound Emerg Dis 2018 Sep 4.
(29) Pursell AR, Stuart BP, Styer E, Case JL. Isolation of an Adenovirus from Black Bear Cubs. J Wildl Dis 1983 07/01; 2018/10;19(3):269-271.
(30) Millan J, Lopez-Bao JV, Garcia EJ, Oleaga A, Llaneza L, Palacios V, et al. Patterns of Exposure of Iberian Wolves (Canis lupus) to Canine Viruses in Human-Dominated Landscapes. Ecohealth 2016 Mar;13(1):123-134.
(31) Greene CE. Infectious diseases of the dog and cat. St. Louis, Mo.: Elsevier/Saunders; 2012. (32) Caudell D, Confer AW, Fulton RW, Berry A, Saliki JT, Fent GM, et al. Diagnosis of Infectious Canine Hepatitis Virus (CAV-1) Infection in Puppies with Encephalopathy. J Vet Diagn Invest 2005 01/01; 2018/06;17(1):58-61.
(33) Sykes JE. Infectious Canine Hepatitis. Canine and Feline Infectious Diseases; 2013. p. 182-186.
(34) Decaro N, Campolo M, Elia G, Buonavoglia D, Colaianni ML, Lorusso A, et al. Infectious canine hepatitis: an "old" disease reemerging in Italy. Res Vet Sci 2007 Oct;83(2):269-273.
(35) Wong M, Woolford L, Hasan NH, Hemmatzadeh F. A Novel Recombinant Canine Adenovirus Type 1 Detected from Acute Lethal Cases of Infectious Canine Hepatitis. Viral Immunol 2017;30(4):258-263.
(36) Viitanen SJ, Lappalainen A, Rajamaki M. Co-infections with Respiratory Viruses in Dogs with Bacterial Pneumonia. Journal of Veterinary Internal Medicine 2015 01/19;29(2):544-551.
(37) Edinboro CH, Ward MP, Glickman LT. A placebo-controlled trial of two intranasal vaccines to prevent tracheobronchitis (kennel cough) in dogs entering a humane shelter. Preventive Veterinary Medicine 2004 26 February 2004;62(2):89-99.
40 (39) Monteiro FL, Cargnelutti JF, Martins M, Anziliero D, Erhardt MM, Weiblen R, et al. Detection of respiratory viruses in shelter dogs maintained under varying environmental conditions. Brazilian journal of microbiology : [publication of the Brazilian Society for Microbiology] 2016;47(4):876-881.
(40) Ruch-Gallie R, Moroff S, Lappin MR. Adenovirus 2, Bordetella bronchiseptica, and Parainfluenza Molecular Diagnostic Assay Results in Puppies After vaccination with Modified Live Vaccines. Journal of Veterinary Internal Medicine 2016;30(1):164-166.
(41) Ellis JA, Krakowka GS. A review of canine parainfluenza virus infection in dogs. J Am Vet Med Assoc 2012 Feb 1;240(3):273-284.
(42) Kalbermatter D, Shrestha N, Ader-Ebert N, Herren M, Moll P, Plemper RK, et al. Primary Resistance Mechanism of the Canine Distemper Virus Fusion Protein against a Small-Molecule Membrane Fusion Inhibitor. Virus Res 2018 Oct 5.
(43) Pratelli A, Colao V, Losurdo M. Serological and virological detection of canine herpesvirus-1 in adult dogs with and without reproductive disorders. Vet J 2014 May;200(2):257-260.
(44) Bottinelli M, Rampacci E, Stefanetti V, Marenzoni ML, Malmlov AM, Coletti M, et al. Serological and biomolecular survey on canine herpesvirus-1 infection in a dog breeding kennel. J Vet Med Sci 2016 Jun 1;78(5):797-802.
(45) Ledbetter EC, da Silva EC, Kim SG, Dubovi EJ, Schwark WS. Frequency of spontaneous canine herpesvirus-1 reactivation and ocular viral shedding in latently infected dogs and canine herpesvirus-1 reactivation and ocular viral shedding induced by topical administration of cyclosporine and systemic administration of corticosteroids. Am J Vet Res 2012 Jul;73(7):1079-1084.
(46) Priestnall SL, Mitchell JA, Walker CA, Erles K, Brownlie J. New and emerging pathogens in canine infectious respiratory disease. Vet Pathol 2014 Mar;51(2):492-504.
(47) Schulz BS, Kurz S, Weber K, Balzer HJ, Hartmann K. Detection of respiratory viruses and Bordetella bronchiseptica in dogs with acute respiratory tract infections. Vet J 2014 Sep;201(3):365-369.
(48) Knesl O, Allan FJ, Shields S. The seroprevalence of canine respiratory coronavirus and canine influenza virus in dogs in New Zealand. N Z Vet J 2009 Oct;57(5):295-298.
(49) Lavan R, Knesl O. Prevalence of canine infectious respiratory pathogens in asymptomatic dogs presented at US animal shelters. J Small Anim Pract 2015 Sep;56(9):572-576.
(50) Li L, Pesavento PA, Leutenegger CM, Estrada M, Coffey LL, Naccache SN, et al. A novel bocavirus in canine liver. Virol J 2013 Feb 13;10:54-422X-10-54.
41 during infection with canine respiratory coronavirus (CRCoV). Vet Immunol Immunopathol 2009 Jan 15;127(1-2):38-46.
(52) Castleman WL, Powe JR, Crawford PC, Gibbs EP, Dubovi EJ, Donis RO, et al. Canine H3N8 influenza virus infection in dogs and mice. Vet Pathol 2010 May;47(3):507-517.
(53) Kaczorek E, Schulz P, Maczewska J, Wojcik R, Krzysztof Siwicki A, Stopyra A, et al. Prevalence of respiratory pathogens detected in dogs with kennel cough in Poland. ; 2017.
(54) Bhardwaj M, Singh B, Vadhana P. Bordetella Bronchiseptica Infection and Kennel Cough in Dogs. ; 2013.
(55) Pintore MD, Corbellini D, Chieppa MN, Vallino Costassa E, Florio CL, Varello K, et al. Canine adenovirus type 1 and Pasteurella pneumotropica coinfection in a puppy. Vet Ital 2016 Jan-Mar;52(1):57-62.
(56) An D, Jeoung H, Jeong W, Chae S, Song D, Oh J, et al. A serological survey of canine respiratory coronavirus and canine influenza virus in Korean dogs. The Journal of veterinary medical science 2010 September;72(9):1217-1219.
(57) de Vries R,D., Duprex WP, de Swart R,L. Morbillivirus Infections: An Introduction. Viruses 2015 02/05;7(2):699-706.
(58) Headley SA, Saito TB. Simultaneous canine distemper encephalitis and canine parvovirus infections with distemper-associated cardiac necrosis in a pup. 2003.
(59) Miranda C, Thompson G. Canine parvovirus: the worldwide occurrence of antigenic variants. J Gen Virol 2016 Sep;97(9):2043-2057.
(60) Miranda C, Carvalheira J, Parrish CR, Thompson G. Factors affecting the occurrence of canine parvovirus in dogs. Vet Microbiol 2015 Oct 22;180(1-2):59-64.
(61) Decaro N, Desario C, Parisi A, Martella V, Lorusso A, Miccolupo A, et al. Genetic analysis of canine parvovirus type 2c. Virology 2009 Mar 1;385(1):5-10.
(62) Decaro N, Buonavoglia C. Canine parvovirus--a review of epidemiological and diagnostic aspects, with emphasis on type 2c. Vet Microbiol 2012 Feb 24;155(1):1-12.
(63) Sime TA, Powell LL, Schildt JC, Olson EJ. Parvoviral myocarditis in a 5-week-old Dachshund. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care 2015 11/01; 2018/10;25(6):765-769.
(64) Houston DM, Ribble CS, Head LL. Risk factors associated with parvovirus enteritis in dogs: 283 cases (1982-1991). J Am Vet Med Assoc 1996 Feb 15;208(4):542-546.
42 (66) Castro TX, Cubel Garcia Rde C, Goncalves LP, Costa EM, Marcello GC, Labarthe NV, et al. Clinical, hematological, and biochemical findings in puppies with coronavirus and parvovirus enteritis. Can Vet J 2013 Sep;54(9):885-888.
(67) Hu RL, Huang G, Qiu W, Zhong ZH, Xia XZ, Yin Z. Detection and differentiation of CAV-1 and CAV-2 by polymerase chain reaction. Vet Res Commun 2001 Jan;25(1):77-84.
(68) Chaturvedi U, Tiwari AK, Ratta B, Ravindra PV, Rajawat YS, Palia SK, et al. Detection of canine adenoviral infections in urine and faeces by the polymerase chain reaction. J Virol Methods 2008 May;149(2):260-263.
(69) Yoon S, Byun J, Park Y, Kim M, Bae Y, Song J. Comparison of the diagnostic methods on the canine adenovirus type 2 infection. Basic and Applied Pathology 2010 06/01; 2018/10;3(2):52-56. (70) Kalinowski M, Adaszek L, Miloszowska P, Skrzypczak M, Zietek-Barszcz A, Kutrzuba J, et al. Molecular analysis of a fragment of gene E1B 19K of canine adenovirus 2 (CAV-2) isolated from dogs with symptoms of cough. Pol J Vet Sci 2012;15(3):425-430.
(71) Cornwell HJ, Thompson H, McCandlish IA, Macartney L, Nash AS. Encephalitis in dogs associated with a batch of canine distemper (Rockborn) vaccine. Vet Rec 1988 Jan 16;122(3):54-59.
(72) Gore TC, Lakshmanan N, Duncan KL, Coyne MJ, Lum MA, Sterner FJ. Three-year duration of immunity in dogs following vaccination against canine adenovirus type-1, canine parvovirus, and canine distemper virus. Vet Ther 2005 Spring;6(1):5-14.
(73) Belsare AV, Gompper ME. Assessing demographic and epidemiologic parameters of rural dog populations in India during mass vaccination campaigns. Prev Vet Med 2013 Aug 1;111(1-2):139-146.
(74) Sowman HR, Cave NJ, Dunowska M. A survey of canine respiratory pathogens in New Zealand dogs. N Z Vet J 2018 Sep;66(5):236-242.
(75) Cornwell HJ, Paterson SD, McCandlish IA, Thompson H, Wright NG. Immunity to canine adenovirus respiratory disease: effect of vaccination with an inactivated vaccine. Vet Rec 1983 Nov 26;113(22):509-512.
(76) Bass EP, Gill MA, Beckenhauer WH. Evaluation of a canine adenovirus type 2 strain as a replacement for infectious canine hepatitis vaccine. J Am Vet Med Assoc 1980 Aug 1;177(3):234-242.
43 (78) Deng X, Zhang J, Su J, Liu H, Cong Y, Zhang L, et al. A multiplex PCR method for the simultaneous detection of three viruses associated with canine viral enteric infections. Arch Virol 2018 Aug;163(8):2133-2138.
(79) Alves CDBT, Granados OFO, Budaszewski RdF, Streck AF, Weber MN, Cibulski SP, et al. Identification of enteric viruses circulating in a dog population with low vaccine coverage. Brazilian Journal of Microbiology 2018 October–December 2018;49(4):790-794.
