Aplicació de tècniques voltamperomètriques i
cronopotenciomètriques de redissolució a l’especiació
d’ions metàl·lics
Núria Serrano i Plana
Departament de Química Analítica Barcelona, 2007
II. EXPERIMENTAL
Instrumentació i reactius
CAPÍTOL 3
Instrumentació i reactius
59
CAPÍTOL 3.Instrumentació i reactius
3.1 INSTRUMENTACIÓ
Per als estudis voltamperomètrics d’especiació realitzats al llarg d’aquesta Tesi s’han utilitzat quatre tipus d’elèctrodes de treball: l’elèctrode de gotes de mercuri que pot treballar com a elèctrode de gotes de mercuri estàtiques (SMDE), i com a elèctrode de gota penjant (HMDE), l’elèctrode de disc rotatori de carboni vitrificat sobre el qual es diposita una fina pel·lícula de mercuri (MF-GCRDE), l’elèctrode de carboni vitrificat sobre el qual es diposita una fina pel·lícula de mercuri (MF-GC) i l’elèctrode d’amalgama sòlida de plata on s’hi diposita una fina pel·lícula de mercuri (MF- AgSAE). A part de l’elèctrode de treball, la cel·la voltamperomètrica consta de dos elèctrodes més, l’auxiliar i el de referència. S’ha utilitzat com a elèctrode auxiliar un elèctrode de carboni vitrificat i com a elèctrode de referència un Ag/AgCl, KCl (3M).
En la figura 3.1 es mostra una representació de la instrumentació polarogràfica i els diferents elèctrodes utilitzats en aquesta Tesi.
Figura 3.1. Instrumentació polarogràfica i tipus d’elèctrodes utilitzats. A) Stand polarogràfic 663 VA amb cel·la voltamperomètrica B) Cel·la voltamperomètrica amb RDE C) Elèctrode auxiliar de carboni vitrificat D) Elèctrode de referència Ag/AgCl (KCl 3M) E) Elèctrode multimode de mercuri (SMDE i HMDE) F) Elèctrode de disc rotatori G) Puntes d’elèctrodes de
F A
B
C D
E G H
Instrumentació i reactius
61 Les mesures voltamperomètriques i cronopotenciomètriques s’han realitzat amb equips Autolab System (PGSTAT20 i PGSTAT12) de la casa Eco Chemie (The Netherlands), connectats a un stand polarogràfic 663 VA (Metrohm, Switzerland) i un ordinador personal, mitjançant el software d’adquisició de dades GPES 4 versió 4.9 (Eco Chemie).
Només en el cas de les mesures per cronopotenciometria de redissolució amb acumulació per adsorció (AdSCP) s’ha utilitzat un polarògraf PC-ETP acoblat a un ordinador personal, a través del software Polar4 (Polaro Sensors, Czech Republic). Al sistema s’ha connectat un dosificador Dosimat 665 (Metrohm) per realitzar addicions automàtiques de solucions de lligand o d’ió metàl·lic, mentre que les addicions manuals es van realitzar amb micropipetes automàtiques Nichipet EX (Nichiryo).
Les mesures de pH es van portar a terme amb un elèctrode combinat Orion 9103SC unit a un pH-metre Orion SA 920.
La figura 3.2 mostra un esquema del muntatge experimental emprat en les valoracions voltamperomètriques i cronopotenciomètriques.
Les valoracions conductomètriques s’han realitzat a 25ºC amb un conductímetre Orion 120 connectat a una cel·la conductomètrica 99-01-01 (constant de cel·la 1.03 cm-1) i a una bureta automàtica Dosimat 665 (Metrohm).
Les mesures potenciomètriques de concentració de cadmi lliure es van realitzar en una cel·la electroquímica que contenia un elèctrode d’ió selectiu Cd-ISE (Metrohm, Switzerland) i un elèctrode de referència (Metrohm, Switzerland), acoblats a un valorador automàtic 809 Titrando (Metrohm, Switzerland) i a un ordinador personal amb el software d’adquisició de dades Tiamo versió 1.0.
3.2 REACTIUS I SOLUCIONS
Les metal·lotioneïnes, Cd-Zn-MT (lot 052K7012, amb un contingut en cadmi del 3% i un contingut en zinc del 1%) i Zn-MT II (lot 51K7005, amb un contingut en zinc del 4.1% i un contingut en cadmi del 0.3%), i el glutatió, GSH (L-glutatió reduït, ≥ 98%) es van obtenir de Sigma-Aldrich.
Figura 3.2. Esquema del muntatge experimental emprat en les valoracions voltamperomètriques i cronopotenciomètriques.
La fitoquelatina (PC2), (γ-Glu-Cys)2-Gly va ser sintetitzada pel mètode de Merrifield [52] en el Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, AS CR, Prague.
Totes les dissolucions emprades en aquesta Tesi s’han preparat a partir de reactius de qualitat analítica:
NOM FÓRMULA CASA COMERCIAL
Nitrat de cadmi Cd(NO3)2 . 4H2O Merck
Nitrat de plom Pb(NO3)2 . 4H2O Merck
Nitrat de zinc Zn(NO3)2 . 4H2O Merck
Nitrat de potassi KNO3 Merck
Autolab PGSTAT 12
pH metre
Stand 663 VA Metrohm
Micropipetes
DPP RPP ASV SCP SSCP AdSCP
Ordinador amb software GPES 4.9 N2
Dosimat
Cel·la electroquímica
Autolab PGSTAT 12
pH metre
Stand 663 VA Metrohm
Micropipetes
DPP RPP ASV SCP SSCP AdSCP
Ordinador amb software GPES 4.9 N2
Dosimat
Cel·la electroquímica
Instrumentació i reactius
63
Àcid clorhídric HCl al 30% Merck
Àcid nítric HNO3 al 65% Merck
Tetraborat de sodi Na2B4O7 . 10 H2O Merck
Glicina, àcid aminoacètic C2H5NO2 Sigma-Aldrich
Tris (hidroximetil)-aminometà C4H11NO3 Merck
Clorur de mercuri (II) HgCl2 Probus
Clorur de potassi KCl Merck
Etanol absolut EtOH Merck
Àcid polimetacrílic PMA BDH
Sal disòdica de l’àcid
etilendiaminatetraacètic, EDTA C10H14N2Na2O8 . 2H2O Panreac
Peròxid d’hidrogen H2O2 al 30 % Panreac
Dicromat de potassi K2Cr2O7 Panreac
Iodur de potassi KI Merck
Etilendiamina C2H8N2 Sigma-Aldrich
Hidrogenftalat de potassi C8H5KO4 Merck
Totes les solucions s’han preparat amb aigua ultrapura obtinguda amb un equip de purificació d’aigua Milli-Q plus 185, de la casa Millipore.
Per tal d’eliminar l’oxigen de les solucions, s’ha utilitzat nitrogen purificat SEO N50.
Elèctrodes sòlids
CAPÍTOL 4
Elèctrodes sòlids
67
CAPÍTOL 4.Elèctrodes sòlids
4.1 PREPARACIÓ DE LA SUPERFÍCIE
Al llarg d’aquesta Tesi s’han utilitzat dos tipus d’elèctrode sòlids de treball sobre els quals es diposita una fina pel·lícula de mercuri: un elèctrode rotatori de carboni vitrificat en forma de disc (Metrohm), amb un diàmetre de 2 mm, fixat a un cilindre de tefló de 7 mm de diàmetre (MF-GCRDE) i un elèctrode d’amalgama sòlida de plata amb una superfície activa de 0.4 mm de diàmetre preparat tal i com s’indica en la bibliografia [53].
Prèviament a la preparació de la pel·lícula de mercuri és necessari polir l’elèctrode per tal d’assegurar que la seva superfície sigui completament llisa i la pel·lícula esdevingui completament homogènia. Tots els elements utilitzats formen part d’un “kit” de polir (figura 4.1 a) que consta de diferents superfícies de poliment, uns suports de vidre i recipients amb suspensions de diamant i d’alúmina de diferent mida de partícula.
Per polir els elèctrodes s’han seguit les següents etapes (figura 4.1 b):
1. S’enganxa una superfície de poliment sobre el suport de vidre per tenir una superfície llisa que pugui retenir l’agent abrasiu.
2. A continuació es neteja la superfície de l’elèctrode amb aigua seguida d’etanol per tal d’eliminar el material adherit que hi pugui haver en aquesta. Després, s’asseca amb l’ajuda d’un tros de paper suau.
3. Seguidament s’humiteja la superfície de poliment amb aigua destil·lada i s’afegeixen unes gotes de suspensió abrasiva (es comença sempre amb la de menor mida de partícula) de manera uniforme.
4. L’elèctrode es col·loca cara avall en contacte amb la superfície de poliment i es realitza un moviment en forma de vuit sempre en el mateix sentit. És convenient canviar el punt de pressió sobre l’elèctrode per assegurar un polit uniforme.
5. Després d’uns minuts es neteja l’elèctrode amb aigua per eliminar les partícules que realitzen el polit i finalment es neteja amb etanol.
4.2 PREPARACIÓ DE LA PEL·LÍCULA DE MERCURI EN EL MF-GCRDE
Per fixar la pel·lícula de mercuri en l’elèctrode de carboni es prepara una solució que conté 200 mg/l de clorur de mercuri (II) en àcid clorhídric 0.1 mol l-1.
S’introdueixen 20 ml d’aquesta solució a la cel·la electroquímica que conté a més de l’elèctrode de carboni vitrificat, sobre el qual es dipositarà la pel·lícula de mercuri, un elèctrode auxiliar de carboni vitrificat i un elèctrode de referència de Ag/AgCl, KCl (3 M), KNO3 (0.01 M). Es purga i s’agita la solució durant deu minuts. S’ajusta el potencial a –0.5 V vs. Ag/AgCl i es realitza una deposició de dos minuts, durant la qual el Hg(II) es redueix a Hg0 sobre la superfície de carboni i es comença a generar la pel·lícula. Tot seguit es fa una etapa d’equilibri de 30 segons de durada. Després, es canvia el potencial a –0.6 V vs. Ag/AgCl, i es realitza una altra vegada la deposició i l’etapa d’equilibri. Aquest procediment es repeteix per –0.7, –0.8 i –0.9 V. A –0.9 V el cicle de deposició / reoxidació es repeteix tres vegades més, de manera que el temps total de deposició per a la realització de la pel·lícula de mercuri és de setze minuts.
Elèctrodes sòlids
69 Figura 4.1. Manteniment de l’elèctrode. a)”Kit” de polir b)Passos a seguir per polir l’elèctrode.
Una vegada es forma la fina pel·lícula de mercuri sobre l’elèctrode de carboni vitrificat, aquest pot ser utilitzat durant tot un dia. La solució preparada per a la realització de la pel·lícula pot ser utilitzada diverses vegades, tot i que abans de la generació d’una nova pel·lícula de mercuri cal polir una altra vegada l’elèctrode, tal com s’ha indicat anteriorment.
Etanol
a)
b)
1. 3.
4.
2.
5. Etan
Etanolol
a)
b)
1. 3.
4.
2.
5.
4.3 PREPARACIÓ I ACTIVACIÓ DE LA PEL·LÍCULA DE MERCURI EN EL MF-AgSAE
Per a la deposició de la pel·lícula de mercuri en l’elèctrode d’amalgama sòlida de plata, es prepara una solució que conté 0.01 mol l-1 de clorur de mercuri (II) en àcid clorhídric 0.1 M.
L’elèctrode d’amalgama sòlida de plata s’introdueix, juntament amb l’elèctrode de referència (Ag/AgCl, KCl (3 M), KNO3 (0.01 M)) i l’elèctrode auxiliar de carboni vitrificat, a la cel·la amb 20 ml d’aquesta solució. S’ajusta el potencial a –0.8 V vs.
Ag/AgCl i es realitza una deposició de deu minuts agitant la solució. Després de la deposició de la pel·lícula de mercuri, la superfície s’activa electroquímicament en una solució de clorur de potassi 0.2 mol l-1, mitjançant l’aplicació d’un potencial de -0.22 V vs. Ag/AgCl durant cinc minuts amb agitació de la solució.
4.4 SEGUIMENT DE LA SUPERFÍCIE ACTIVA DEL MF-CGRDE PER MICROSCÒPIA ÒPTICA
Mitjançant un microscopi òptic (Olimpus-BH2-UMA) acoblat a una càmera de vídeo (JVC-TK-1270) s’ha realitzat un seguiment de la superfície activa de l’elèctrode de disc rotatori de carboni vitrificat, al llarg del procés de manteniment de l’elèctrode, preparació de la pel·lícula i del seu posterior ús (figura 4.2).
S’observa que la superfície de l’elèctrode abans de ser polida (figura 4.2 a) es troba coberta de ratllades, que impedirien la formació d’una pel·lícula de mercuri homogènia.
Però, una vegada realitzat el manteniment de l’elèctrode de manera adequada, aquestes alteracions en la zona activa de l’elèctrode s’eliminen i s’obté una superfície llisa, preparada per a què la deposició de la pel·lícula de mercuri es produeixi de manera adequada (figura 4.2 b).
Seguint el protocol de preparació de la pel·lícula de mercuri es procedeix a realitzar la deposició de la fina capa de mercuri sobre la zona activa de l’elèctrode i un cop es comprova que la pel·lícula es forma de manera homogènia (figura 4.2 c.1 i 4.2 c.2), es sotmet l’elèctrode a una valoració voltamperomètrica.
Elèctrodes sòlids
71 Figura 4.2. Imatges de la zona activa d’un MF-CGRDE obtingudes amb un microscopi òptic Olimpus BH2-UMA acoblat a una càmera de vídeo. a) Zona activa sense polir. b) Zona activa polida. c.1 i c.2) Aspecte de la pel·lícula de mercuri acabada de preparar. d.1 i d.2) Aspecte de la pel·lícula de mercuri després de l’ús. En totes les imatges, el mercuri es veu de color més fosc que el grafit.
b) a)
c.1) c.2)
d.1) d.2)
b) a)
c.1) c.2)
d.1) d.2)
a)
c.1) c.2)
d.1) d.2)
Després de la valoració, s’observa que la pel·lícula de mercuri (figura 4.2 d.1 i 4.2 d.2) continua sent força homogènia malgrat que una petita part de mercuri sembla que s’ha perdut en l’ús.
Metodologia experimental
CAPÍTOL 5
Metodologia experimental
75
CAPÍTOL 5.Metodologia experimental
5.1 CALIBRATGE DE L’ELÈCTRODE SELECTIU DE CADMI
El calibratge de l’elèctrode selectiu (ISE) de Cd(II) es pot realitzar a partir de la mesura del potencial de la cel·la de solucions de concentració d’ió cadmi creixents i perfectament conegudes. La representació del potencial mesurat respecte el menys logaritme de la concentració de cadmi (pCd) ens dóna una representació en forma de recta amb un pendent de -0.0592 / 2, tal i com era d’esperar de l’expressió [27]:
2 pCd 0592 . k 0
Ecell = ' − (5.1)
Per dur a terme aquest calibratge es disposen en la cel·la 25 ml de solució de KNO3 0.01 mol l-1 i amb una bureta automàtica es van fent successives addicions d’una solució d’ió cadmi a la mateixa força iònica.
La figura 5.1 a mostra la corba de calibratge obtinguda per l’ISE de cadmi, però com es pot veure en la corba el comportament Nerstià de l’elèctrode es desvia a pCd ~ 5.
Aquest comportament indica que aquest mètode de calibratge no és adient per a l’ISE a baixes concentracions de metall com les utilitzades en ASV o SCP.
En treballs previs [21, 54] s’ha provat que l’ús d’un agent complexant com l’àcid etilendiaminatetraacètic (EDTA) o l’etilendiamina (en) amplia l’interval on el Cd-ISE té una resposta Nerstiana.
La figura 5.1 b mostra la corba de calibratge del Cd-ISE on l’etilendiamina s’ha seleccionat com a agent complexant i el comportament del Cd-ISE s’ha determinat mesurant solucions que contenen diferents volums d’en (0.1 mol l-1) en 1 10-3 mol l-1 de solució d’ió cadmi, en un interval de concentracions de cadmi lliure entre pCd 3 i pCd 10.3. La cinètica entre el Cd(II) i l’en és lenta, així que és necessari preparar les solucions el dia anterior a la mesura per assegurar que la reacció és completa.
Quan la concentració de cadmi total és 1 10-3 mol l-1, la figura 5.1 b mostra que l’elèctrode Cd-ISE té un comportament Nerstià en un ampli interval de pCd; però si disminueix la concentració total de cadmi (lliure + complexat), la resposta Nerstiana del Cd-ISE no és tan bona. La figura 5.2 mostra que per una concentració total de cadmi de 1 10-5 mol l-1, l’elèctrode selectiu de cadmi té un comportament Nerstià fins a pCd ~ 9, mentre que per una concentració total de 1 10-6 mol l-1 la resposta Nerstiana es perd a pCd ~ 7.
Metodologia experimental
77 Figura 5.1. Corbes de calibratge per l’elèctrode ISE de cadmi.(a) Valoració potenciomètrica de KNO3 amb una solució d’ió cadmi. (b) Calibratge amb una concentració total de cadmi de 1 10-3 mol l-1 i força iònica 0.01 mol l-1 en presència (----) i en absència (----) de diferents volums afegits d’etilendiamina 0.1 mol l-1.
-220 -200 -180 -160 -140 -120 -100
0 2 4 6 8 10 12
pCd
E (mV)
E = – 28.11 pCd – 40.56 R2 = 0.9999
-220 -200 -180 -160 -140 -120 -100
0 2 4 6 8 10 12
pCd
E (mV)
E = – 28.11 pCd – 40.56 R2 = 0.9999
-400 -350 -300 -250 -200 -150 -100
0 2 4 6 8 10 12
pCd
E (mV)
E = – 29.08 pCd – 54.73 R2 = 0.9999
-400 -350 -300 -250 -200 -150 -100
0 2 4 6 8 10 12
pCd
E (mV)
E = – 29.08 pCd – 54.73 R2 = 0.9999
a)
b)
Figura 5.2. Corbes de calibratge per l’elèctrode ISE de cadmi a partir de solucions que contenen diferents volums d’etilendiamina (0.1 mol l-1) en 1 10-3 mol l-1 (----), 1 10-4 mol l-1 (----), 1 10-5 mol l-1 (----) i 1 10-6 mol l-1 (----) de Cd(NO3)2 i força iònica 0.1 mol l-1.
5.2 VERIFICACIÓ DEL COMPLIMENT DE L’EQUACIÓ DE LEVICH
Per comprovar que les condicions hidrodinàmiques de l’elèctrode rotatori asseguren el compliment de l’equació de Levich [27] durant l’etapa de preconcentració, es disposa a la cel·la un volum mesurat de la solució de l’ió metàl·lic (normalment 25 mL) al pH i força iònica adequats, i es desoxigena amb nitrogen durant mitja hora. A continuació es realitzen mesures voltamperomètriques on s’aplica un escombratge de potencial lineal en un interval de velocitats d’agitació entre 100 i 10000 s-1 i es mesura la intensitat límit de l’ona que s’obté.
Per aquest experiment s’utilitza un elèctrode rotatori de carboni vitrificat, sobre el qual s’ha dipositat una fina pel·lícula de mercuri (MF-CGRDE).
-360 -310 -260 -210 -160
3 4 5 6 7 8 9 10 11
pCd
E (mV)
Metodologia experimental
79 La figura 5.3 mostra la representació logarítmica de la intensitat del senyal en funció de la freqüència de rotació. Aquesta intensitat es pot assimilar a la intensitat que circularia durant l’etapa de preconcentració en les mesures per ASV i SCP amb un elèctrode rotatori. Es pot veure que les dades s’ajusten perfectament a una recta de pendent pròxim a 1/2 (equació 2.2), fet que ens indica que l’equació de Levich es compleix en un ampli interval de velocitat d’agitació.
Figura 5.3. Estimació del compliment de l’equació de Levich. En MFE-RDE. Representació logarítmica de la intensitat límit en funció de la freqüència de rotació. [Cd(II)]= 10-6 mol l-1, força iònica 0.01 mol l-1. Interval de freqüència de rotació entre 102 i 104 s-1.
5.3 ESTIMACIÓ DEL RÈGIM DE REDISSOLUCIÓ EN SCP
En cronopotenciometria de redissolució (SCP), depenent del valor de la intensitat de redissolució (Iox), les condicions predominants durant l’etapa de redissolució poden variar entre la difusió lineal semi-infinita, on Iτ1/2 és constant i τ ∝ c2 (equació 2.7) i la redissolució total, on Iτ és constant i τ ∝ c (equació 2.8).
5.3.1 Dependència del temps de transició en SCP (ττττ) amb la intensitat
Per trobar la dependència que s’estableix entre la intensitat i el temps de transició, es diposita a la cel·la un volum mesurat de la solució de l’ió metàl·lic (normalment 25 mL) al pH i força iònica adequats, i es desoxigena amb nitrogen durant mitja hora. A
-6.8 -6.6 -6.4 -6.2 -6 -5.8 -5.6
2 2.5 3 3.5 4
Log ωωωω Log I d
logωωωω logId
log Id= 0.5137 logω + log cte R2 = 0.9981
-6.8 -6.6 -6.4 -6.2 -6 -5.8 -5.6
2 2.5 3 3.5 4
Log ωωωω Log I d
logωωωω logId
-6.8 -6.6 -6.4 -6.2 -6 -5.8 -5.6
2 2.5 3 3.5 4
Log ωωωω Log I d
logωωωω logId
log Id= 0.5137 logω + log cte R2 = 0.9981
continuació es realitzen diverses mesures cronopotenciomètriques a diferents intensitats constants d’oxidació, que proporcionaran els valors de la τ i del potencial.
Les mesures cronopotenciomètriques es realitzen mitjançant la tècnica de cronopotenciometria de redissolució en la variant d’intensitat constant d’oxidació (CCSCP), utilitzant dos elèctrodes de treball diferents, l’elèctrode de gota penjant de mercuri (HMDE) i l’elèctrode rotatori de carboni vitrificat amb pel·lícula de mercuri (MF-CGRDE).
Els paràmetres instrumentals seleccionats han estat: potencial de deposició de –0.95 V, temps de deposició de 120 s, temps d’equilibri de 30 s (quan l’elèctrode de treball és l’HMDE) i una intensitat constant d’oxidació que ha oscil·lat entre 10-6 i 10-13 A.
5.3.2 Dependència del temps de transició en SCP (ττττ) amb la concentració
Per saber la dependència que s’estableix entre el temps de transició i la concentració, es disposa a la cel·la un volum mesurat de la solució de KNO3 (normalment 15 mL), i es desoxigena amb nitrogen durant mitja hora.
A continuació es realitza una mesura cronopotenciomètrica que donarà el valor de τ i el potencial en absència d’ió metàl·lic. Seguidament, es realitzen addicions successives d’un determinat volum de solució de l’ió metàl·lic (normalment entre 25 i 100µL).
Després de cada addició es desoxigena la solució uns 60 s i es realitzen les mesures cronopotenciomètriques que proporcionen els valors de la τ i del potencial en presència de l’ió metàl·lic.
Les mesures cronopotenciomètriques es van realitzar per la tècnica de cronopotenciometria de redissolució en la variant d’intensitat constant d’oxidació (CCSCP).
Aquest experiment es va realitzar utilitzant l’elèctrode de gota penjant de mercuri (HMDE) i l’elèctrode rotatori de carboni vitrificat amb pel·lícula de mercuri (MF- CGRDE).
Els paràmetres instrumentals seleccionats han estat: potencial de deposició de –0.95 V,
Metodologia experimental
81 l’HMDE) i una intensitat constant d’oxidació de 10-6 A o de 10-9 A en funció de l’experiment.
5.4 VALORACIONS VOLTAMPEROMÈTRIQUES I CRONOPOTENCIOMÈTRIQUES
Les valoracions voltamperomètriques i cronopotenciomètriques de redissolució comencen disposant en la cel·la electroquímica un volum perfectament conegut (normalment 25 mL) de la solució de l’ió metàl·lic o de la solució de lligand, depenent del cas, al pH i força iònica adequats; seguidament es desoxigena amb nitrogen durant mitja hora. A continuació es realitzen diverses mesures voltamperomètriques i/o cronopotenciomètriques per fixar amb precisió la intensitat límit (o de pic), el potencial de semiona (o de pic) i el temps de transició de l’ió metàl·lic en absència de lligand o del lligand en absència d’ió metàl·lic. Seguidament, en funció de la valoració, es realitzen addicions successives d’un determinat volum de solució de lligand o d’ió metàl·lic. Després de cada addició es desoxigena la solució 60 s i es realitzen les mesures voltamperomètriques i cronopotenciomètriques que proporcionen els valors de la intensitat, del potencial i del temps de transició (τ) de l’ió metàl·lic en presència del lligand o del lligand en presència de l’ió metàl·lic.
El disseny dels experiments es va fer de manera que es poguessin realitzar les mesures per les diferents tècniques successivament.
Sistemes estudiats
CAPÍTOL 6
Sistemes estudiats
85
CAPÍTOL 6.Sistemes estudiats
6.1 INTRODUCCIÓ
Els medis naturals contenen una gran varietat de lligands (senzills, macromoleculars, col·loïdals) que interaccionen amb els metalls pesants. És per això que en l’estudi de la complexació s’ha de considerar diferents tipus de lligands. En els estudis electroquímics de complexació s’ha de considerar a més, la possibilitat de la presència de fenòmens d’adsorció electròdica.
Com a model per a l’estudi electroquímic de la complexació que té lloc en els medis naturals entre ions metàl·lics pesants i lligands, s’ha seleccionat els sistemes següents: el Cd(II)-glicina i el Cd(II)-ftalat com a models de complexació amb lligands senzills on es formen complexos làbils i sense adsorció electròdica; el Cd(II)-iodur com a model de complexació amb lligands senzills on es formen complexos làbils però amb adsorció electròdica; el Cd(II)-PMA com a model de sistema on es formen complexos làbils macromoleculars i amb adsorció electròdica; el Cd(II)-EDTA-PMA com a model per a l’estudi de sistemes on coexisteixen complexos metàl·lics macromoleculars làbils i
complexos inerts; i el Cd(II)-Pb(II)-ftalat com a model per a l’estudi de la formació de complexos làbils quan en el medi hi ha una mescla d’ions metàl·lics. Igualment s’ha estudiat la complexació amb el glutatió, les metal·lotioneïnes i les fitoquelatines per la seva química de coordinació, per la gran varietat de senyals solapats que originen a les mesures voltamperomètriques i per la forta adsorció electròdica que presenten els grups tiols, característics d’aquestes espècies.
6.2 EXPERIMENTS AMB Cd(II)-GLICINA
La glicina (àcid 2-aminoacètic, HL) és l’àcid α-aminocarboxílic més senzill (H2N-CH2- CO2H). La forma zwiteriònica és la més afavorida energèticament en solució i en estat sòlid. La forma totalment protonada és el catió glicina, H2L+, que conté dos protons ionitzables i que es pot dissociar en dues etapes perfectament diferenciades. Així doncs, depenent del pH de la solució, la glicina pot existir en tres formes diferents: la catiònica, H2L+, la zwiteriònica, HL±, i l’aniònica, L−. Els equilibris àcid-base corresponents a aquestes espècies són:
Ka1 = 10−2.35 (6.1) Ka2 = 10−9.76 (6.2)
La glicina és per tant un aminoàcid i com a tal, un candidat potencial per a l’especiació de metalls en medis naturals. S’ha de considerar que els aminoàcids són un dels grups de compostos orgànics que existeixen com a productes de descomposició de la matèria orgànica en medis naturals, el que fa que l’estudi d’aquesta espècie química amb el Cd(II) sigui interessant per aprofundir en els estudis d’especiació.
Per altra banda, la glicina pot actuar com a lligand bidentat amb la majoria d’ions metàl·lics. Segons la bibliografia [55] el Cd(II) forma amb la glicina els complexos successius 1:1 i 1:2, tot i que alguns autors també detecten el complex 1:3. S’ha de tenir en compte que a pH àcids pot formar complexos protonats amb algun metall i a pH elevats si no hi ha excés de lligand pot formar hidrocomplexos mixtos solubles.
En l’estudi amb aquest lligand s’ha treballat a unes condicions on predominen els complexos amb el glicinat. El pH escollit ha estat de 7.5 i s’ha mantingut constant
L+
H2 HL±+ H+ HL ± L−+ H+
Sistemes estudiats
87 força iònica); en aquestes condicions encara que hi hagi un excés de forma zwiteriònica respecte a la forma aniònica, aquesta última es troba pràcticament en excés respecte a l’ió metàl·lic i per tant es pensa que els complexos formats són del tipus MLn [56]. A aquests valors de pH els ions considerats no formen hidrocomplexos de forma apreciable ni s’adsorbeixen a les parets dels recipients utilitzats [57].
Les mesures voltamperomètriques es van realitzar mitjançant les tècniques de polarografia diferencial d’impulsos (DPP) i voltamperometria per redissolució anòdica (ASV), en la seva variant d’impulsos diferencial. Les mesures cronopotenciomètriques es van realitzar mitjançant la tècnica de cronopotenciometria de redissolució en la variant d’intensitat constant d’oxidació (CCSCP). En les mesures polarogràfiques s’ha utilitzat un elèctrode de gotes de mercuri estacionari (SMDE) i en les d’ASV i CCSCP s’ha utilitzat, en funció de l’experiment, un HMDE o un elèctrode rotatori de carboni vitrificat amb pel·lícula de mercuri (taula 6.1).
6.3 EXPERIMENTS AMB Cd(II)-PMA
L’àcid polimetacrílic (PMA) és un lligand macromolecular que com la majoria de complexants macromoleculars presenta dues característiques fonamentals: naturalesa polielectrolítica i propietats conformacionals [58]. La naturalesa polielectrolítica es deu a la presència, segons el pH, d’un gran nombre de grups funcionals carregats sobre la macromolècula que donen una considerable densitat de càrrega sobre la mateixa (poliió). Aquesta càrrega (generalment negativa) es troba compensada electrostàticament per un gran nombre d’ions senzills de càrrega oposada (contraions).
Les propietats conformacionals fan referència a les diferents distribucions espacials que pot adoptar la macromolècula i que van des d’una conformació compacta (cadenes totalment enrotllades sobre si mateixes, en forma de cabdell) a una conformació extensa (cadenes totalment esteses).
El PMA presenta l’interès addicional de ser àmpliament utilitzat com a preparador de terres i en el tractament d’aigües, i per tant pot trobar-se present en mostres mediambientals.
La fórmula del PMA es mostra a continuació:
(6.3)
La massa molecular mitjana del PMA (segons la casa comercial BDH) és de 26000 g/mol, i el coeficient de difusió del PMA calculat en la bibliografia [59] és de 1.5 10 –7 cm2/s per a les masses promig utilitzades.
L’equilibri àcid-base d’un grup àcid HL del poliàcid pot expressar-se com:
Kint = 10−4.9 (6.4)
on Kint és la constant de dissociació intrínseca, és a dir, extrapolada a grau de dissociació zero.
A partir de la solució comercial concentrada de PMA es prepara, per dilució amb aigua, i amb una estabilitat aproximada d’un mes, una solució de concentració pròxima a 0.1 mol l-1. Tant la solució concentrada com la diluïda es conserven a la nevera a uns 4ºC i protegides de la llum per evitar la seva descomposició. La concentració de la solució mare es determina mitjançant valoració conductomètrica amb una solució estàndard de KOH 0.1 mol l-1 i s’expressa en unitats de monòmer, o, el que és el mateix, en concentració de grups carboxílics. En la figura 6.1 es mostra la corba de valoració típica del PMA. La solució així valorada constitueix el patró de reserva.
La solució de PMA que s’utilitza en les valoracions, de concentració pròxima a 10-2 mol l-1, es prepara diàriament a partir d’un volum exactament mesurat de la solució mare del poliàcid. A aquest volum s’afegeix la quantitat de solució estàndard de KOH necessària per aconseguir un grau determinat de neutralització, αn (definit com el quocient entre els equivalents de KOH afegits i els que seria necessari afegir per
HL L−+ H+
H2C C COOH CH3
n
Sistemes estudiats
89 Figura 6.1. Valoració conductomètrica de l’àcid PMA amb KOH 0.1 mol l-1.
En l’estudi d’aquest sistema s’ha treballat a un grau de neutralització de 0.7 (és a dir, un 70% de grups carboxílics ionitzats) i a un pH pròxim a 7, controlant que aquest sigui pràcticament constant al llarg de l’experiment. Això és especialment important, ja que si durant l’experiment les condicions d’acidesa varien, les condicions de complexació canviaran [60] i llavors el model teòric no seria aplicable, doncs ha estat desenvolupat per a un valor únic de la constant de complexació. Seguidament, s’afegeix el volum de solució concentrada de KNO3 necessària per a obtenir la concentració desitjada d’electròlit suport (0.01 mol l-1). A més la solució de PMA ha de contenir una concentració d’ió metàl·lic igual a la de la solució a valorar, amb la finalitat d’evitar l’efecte de la dilució en la cel·la polarogràfica quan es realitzen les addicions. Finalment s’enrasa amb aigua.
Les mesures voltamperomètriques es van realitzar mitjançant les tècniques de polarografia d’impulsos inversa (RPP) i voltamperometria per redissolució anòdica (ASV). Les mesures cronopotenciomètriques es van realitzar mitjançant la tècnica de cronopotenciometria de redissolució en la variant d’intensitat constant d’oxidació (CCSCP). L’elèctrode de treball utilitzat en les mesures per ASV i CCSCP ha estat un HMDE o un MF-GCRDE en funció de l’experiment, mentre que en les mesures polarogràfiques s’ha utilitzat un SMDE (taula 6.1).
-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5
V KOH (ml)
Conductància (mS)
Punt d’equivalència
)
-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5
V KOH (ml)
Conductància (mS)
Punt d’equivalència
)
6.4 EXPERIMENTS AMB Cd(II)-EDTA-PMA
L’àcid etilendiaminatetraacètic (EDTA) és un agent quelant sintètic que pot formar complexos estables i solubles en aigua amb cations metàl·lics di i trivalents, degut a la seva estructura:
(6.5) Els agents quelants, gràcies a la seva capacitat per solubilitzar i inactivar ions metàl·lics mitjançant la formació de complexos, presenten moltes aplicacions, entre elles la millora de la fitoextracció de metalls contaminats dels sòls. L’EDTA, per exemple, s’utilitza en els processos de tintura i acabat de productes tèxtils, en la neteja d’incrustacions de sals en les cares internes de les calderes, com a component de molts productes de neteja, per impedir l’oxidació d’emulsions grasses (maioneses i altres salses, cremes i locions cosmètiques...) evitant que es tornin ràncies, entre molts altres usos [61].
Es van realitzar valoracions dels sistemes Cd-EDTA, Cd-PMA i Cd-EDTA-PMA a un pH de 8 per voltamperometria de redissolució anòdica (ASV) amb HMDE i cronopotenciometria de redissolució en la modalitat d’oxidant químic (SCP) amb HMDE i MF-CGRDE (taula 6.1).
L’equilibri associació-dissociació corresponent al sistema Cd-EDTA és:
(6.6)
on ka i kd són les constants de velocitat d’associació-dissociació respectivament. Els valors recollits en la bibliografia [62] per aquestes constants són: kd= 16.8 s-1 i k = 8.1 x 109 L mol-1 s-1.
CdHEDTA− Cd2++HEDTA kd
ka
HOOC
N
COOH
N COOH
HOOC HOOC
N
COOH
N COOH
HOOC
Sistemes estudiats
91 Les solucions d’EDTA usades en les valoracions es preparen mitjançant dilucions successives d’una solució mare de concentració 10-2 mol l-1, preparada a partir de la sal disòdica i estandarditzada mitjançant volumetria complexomètrica amb zinc [63].
6.5 EXPERIMENTS AMB Cd(II)-Pb(II)-FTALAT
L’àcid ftàlic és un àcid aromàtic dibàsic de fórmula molecular C6H4(COOH)2 amb els dos grups carboxílics en posicions contigües que s’obté per oxidació del naftalè.
Normalment s’utilitza en la seva forma d’anhídrid per tal de proporcionar altres substàncies químiques com són tints, perfums o ftalats entre d’altres. Els equilibris àcid- base corresponents a l’àcid ftàlic són:
Ka1 = 10−2.92 (6.7) Ka2 = 10−5.41 (6.8)
L’àcid ftàlic pot actuar com a lligand bidentat amb la majoria d’ions metàl·lics. Segons la bibliografia [64] el Cd(II) i el Pb(II) formen amb el ftalat els complexos successius 1:1 i 1:2.
Es van realitzar valoracions de cada sistema Cd-ftalat, Pb-ftalat i Cd-Pb-ftalat a un pH de 5.5 per polarografia diferencial d’impulsos (DPP) i per ambdues tècniques de redissolució; voltamperometria de redissolució anòdica (ASV) amb un HMDE i cronopotenciometria de redissolució en la variant d’intensitat constant d’oxidació (CCSCP) amb un HMDE i un MF-GCRDE.
El sistema Cd-ftalat s’ha estudiat addicionalment per cronopotenciometria de redissolució per escombratge (SSCP) amb un HMDE (taula 6.1).
6.6 EXPERIMENTS AMB Cd(II)-IODUR
El iodur forma amb el Cd(II) complexos successius d’estequiometria 1:1, 1:2, 1:3 i 1:4 [65] i presenta l’avantatge de no tenir reaccions paral·leles amb els protons. En canvi, té l’inconvenient de la seva gran afinitat pel mercuri de l’elèctrode, que dóna lloc a l’aparició de senyals anòdiques i a la presència de fenòmens d’adsorció electròdica.
2 4
6H (COOH)
C C6H4(COOH)(COO)−+ H+ )−
COO )(
COOH (
H
C6 4 C6H4(COO)22−+ H+
El sistema Cd-iodur s’ha estudiat per cronopotenciometria de redissolució per escombratge (SSCP) amb un HMDE (taula 6.1).
6.7 EXPERIMENTS AMB METAL·LOTIONEÏNES
Les metal·lotioneïnes (MT) van ser descobertes per Margoshes i Vallee en l’any 1957, quan es van aïllar de l’escorça renal dels equins i es van identificar com a proteïnes capaces d’enllaçar Cd(II).
Les MT són proteïnes conjugades amb un baix pes molecular amb un elevat número de grups sulfhidril provinents dels aminoàcids cisteïna i amb una gran afinitat pels metalls pesants.
S’han identificat en el regne animal, així com en plantes superiors, microorganismes eucariotes i alguns procariotes. En els mamífers, les MT es troben presents en tots els teixits, tot i que són predominants en el fetge, ronyó, pàncrees i intestí. A nivell cel·lular, les MT es localitzen principalment en el citoplasma, tot i que alguns estudis han mostrat la seva presència en el interior dels lisosomes i en el nucli cel·lular.
La classificació més emprada es basa en les característiques estructurals de les MT, i es va establir el 1985 en el Second Internacional Meeting on Metallothionein and Other Low Molecular Weight Metal-binding Proteins, inclou tres classes:
Classe I: comprèn les MT aïllades dels mamífers, i inclou tots aquells polipèptids amb les següents característiques:
Alt contingut de metalls pesants (4-12 àtoms/mol), units a les proteïnes exclusivament per enllaços “tiol” i formant dos dominis metàl·lics.
Alt contingut de cisteïnes (típicament del 23 al 33%), amb una localització constant en la seqüència primària dels aminoàcids de la proteïna, absència d’aminoàcids aromàtics i hidrofòbics.
Baix pes molecular, menor de 10.000 Daltons.
Sistemes estudiats
93 En general, les MT de classe I comparteixen les següents característiques: són pèptids amb 61 o 62 aminoàcids, 20 dels quals són cisteïnes, 6-8 lisines, 7-10 serines i una metionina acetilada en l’extrem amino terminal. No s’ha descrit la presència d’histidines ni d’aminoàcids aromàtics [66, 67].
Classe II: comprèn les MT amb una seqüència d’aminoàcids diferent a la presentada per les MT aïllades dels mamífers. En aquesta classe, la distribució dels aminoàcids cisteïna no es correspon amb la localització de les cisteïnes en les MT de classe I. Aquestes MT s’han trobat en eucariotes unicel·lulars com els llevats i certs procariotes com els cianobacteris. Les MT de la classe I i II es caracteritzen per ser proteïnes de cadena senzilla [67].
Classe III: Les MT de classe III són polipèptids sintetitzats enzimàticament:
els poli(γ-glutamilcisteinil)glicines. Aquests pèptids es poden trobar en diverses plantes i organismes unicel·lulars i reben el nom de fitoquelatines [68].
La síntesi de les MT és fàcilment induïda per una gran quantitat de factors ambientals, fisiològics i patològics.
Els gens que codifiquen la síntesi de les MT són activats quan les cèl·lules s’exposen a la presència de metalls pesants (Mn+) com el Cd(II), Zn(II) i Cu(II), aquesta activació requereix seqüències de bases específiques, que s’han denominat elements regulats per metalls (MREs) [66, 69, 70].
En el procés d’inducció de la síntesi de les MT també hi participa una proteïna nuclear, denominada proteïna regulada per metalls (MRP) que és capaç de reconèixer als MREs i actuar com un factor de transcripció positiu quan es troba present un Mn+. La inducció de la síntesi de les MT en els diferents òrgans depèn del Mn+ i dels diferents sistemes biològics.
Les MT són proteïnes capaces d’enllaçar tant a metalls essencials (Zn i Cu) com a no essencials (Hg, Au, Pb, Cd...). Quan se saturen amb sals de Zn o Cd, fixen 7 àtoms de metall per molècula de proteïna. Els metalls s’agrupen en 2 dominis; el domini anomenat α (C-terminal), conté 11 cisteïnes capaces de fixar 4 àtoms de metall, el
domini β (N-terminal) amb 9 cisteïnes, fixa 3 metalls. Els ions metàl·lics divalents com el Zn i el Cd es coordinen tetrahèdricament amb 4 cisteïnes (figura 6.2) [66, 71, 72].
La unió d’ions monovalents a les MT presenta una estequiometria força diferent a la presentada quan aquesta proteïna s’uneix a ions divalents. S’ha descrit que cada molècula de MT és capaç d’unir 12 metalls monovalents [73].
Figura 6.2. Estructura de les metal·lotioneïnes. (A) MT humana amb els dominis α i β saturats amb quatre i tres àtoms metàl·lics divalents respectivament. (B) MT de cranc amb els seus respectius dominis α i β.
Degut a la fàcil inducció de les MT per diferents metalls, aquestes proteïnes poden actuar com a sistema de detoxificació en els organismes exposats a metalls. A més a més desenvolupen funcions de gran importància en el metabolisme (estabilització de les membranes cel·lulars, captura de radicals lliures i modulació de l’expressió genètica).
Per altra banda, les MT estan relacionades amb diferents malalties humanes: càncer, malalties coronàries, aturada circulatòria o Alzheimer.
Els sistemes Zn-MT i Cd-Zn-MT s’han estudiat per cronopotenciometria de redissolució amb acumulació per adsorció (AdSCP), cronopotenciometria de redissolució en la variant d’intensitat constant d’oxidació (CCSCP), voltamperometria diferencial d’impulsos (DPV) i voltamperometria de corrent continu (DCV). Els elèctrodes de treball utilitzats han estat un HMDE, un elèctrode de carboni vitrificat (GC) i un elèctrode d’amalgama sòlida de plata (AgSAE), sobre els quals es diposita una fina pel·lícula de mercuri (taula 6.1).
Domini ββββ
Domini αααα Domini αααα
Domini ββββ
A) B)
Domini ββββ
Domini αααα Domini αααα
Domini ββββ
A) B)
Sistemes estudiats
95 6.8 EXPERIMENTS AMB GLUTATIÓ I FITOQUELATINES
El glutatió va ser descrit primerament en 1888 amb el nom de philothion pel científic francès J. de Rey-Phailade [74, 75], però no va ser fins al 1929 quan de manera independent en tres laboratoris (els de Pirrie, Kendall i Hopkins) van establir l’estructura del glutatió.
El glutatió és un tripèptid, γ-L-glutamil-L-cisteinilglicina (figura 6.3), que a pH fisiològic té dos grups carboxílics desprotonats i un grup amino protonat. Tot i així el grup sulfhidril (-SH) de la cisteïna és el més reactiu i pot ser un grup donador d’electrons, actuant de nucleòfil, reductor i desactivador de radicals lliures.
El glutatió (GSH) és soluble en aigua i es troba present en animals, plantes i microorganismes, en el citosol cel·lular i en altres fases aquoses. El GSH és un important antioxidant que es troba freqüentment a nivells milimolars dins de les cèl·lules [76-79]. Té diferents funcions, entre les que s’inclou el manteniment de l’estructura i funció d’algunes proteïnes, la de permetre a la cèl·lula eliminar substàncies tòxiques com els radicals lliures o els peròxids, i és essencial per a la protecció de la contaminació per metalls pesants dels sistemes mediambientals. Intervé també en la síntesi del DNA, en el creixement cel·lular i en el manteniment de les funcions immunològiques. Per altra banda, es coneix que els nivells de concentració anòmals de GSH s’associen a malalties específiques com la diabetis, malalties hepàtiques, SIDA i carcinogènesi entre d’altres [80, 81].
El GSH se sintetitza intercel·lularment a partir dels aminoàcids que el constitueixen (cisteïna, àcid glutàmic i glicina) en reaccions catalitzades per la γ-glutamilcisteïna sintetasa (reacció 1 en la figura 6.4) i la glutatió sintetasa (reacció 2 en la figura 6.4). La unió entre el grup carboxílic del glutamat no es fa per la posició α, com en la majoria dels pèptids, sinó per la γ, el que determina la resistència a la hidròlisi per peptidases. El GSH se sintetitza en totes les cèl·lules de mamífer, però els principals òrgans que en regulen la seva síntesi i la de la cisteïna són el fetge, el pulmó i el ronyó.
En les reaccions amb els ions metàl·lics, el GSH actua com a lligand polidentat amb una gran varietat de possibles punts d’enllaç: dos oxígens carboxílics, un nitrogen del grup amino, un grup sulfhidril i dos grups amida [82], però degut a la seva estructura no tots
