INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE

INTRODUZIONE ALLA PARTE

SPERIMENTALE

Il processo di carcinogenesi è il risultato di uno squilibrio tra i fenomeni fisiologici di divisione e crescita cellulare e il normale processo di morte programmata (apoptosi). Nel contesto di questo delicato bilancio, proteine e vie di trasduzione del segnale che regolano la crescita, il differenziamento e lo sviluppo cellulare spesso subiscono alterazioni genetiche che inducono modifiche oncogeniche. Il pathway di PDK1/Akt è una delle vie di segnalazione più importanti nei meccanismi di crescita e sopravvivenza cellulare e rappresenta un target interessante per la ricerca di farmaci antitumorali.

Akt è una serina-treonina chinasi appartenente alla famiglia delle AGC la cui attività ha un ruolo chiave in molti processi cellulari. Tale enzima è costituito da un dominio amminoterminale denominato pleckstrin homology (PH), da un dominio chinasico centrale (Kinase Domain) contenente il sito di legame per l’ATP e da un dominio carbossiterminale (CTD) [30].

Fig.1: Struttura di Akt

A seguito della stimolazione con fattori di crescita e citochine, Akt viene reclutata dal citosol alla membrana plasmatica e attivata attraverso delle rezioni di fosforilazione a livello dei due siti regolatori, Thr308 e Ser473, situati rispettivamente sul dominio chinasico e sul dominio CTD. La chinasi responsabile della prima fosforilazione di Thr308 è la PDK1, mentre la Ser473 sembra essere fosforilata da una seconda chinasi, la PDK2, o dal complesso mTORC2 [5].

L’attivazione di Akt dipende dalla produzione dei fosfoinositoli PtdIns(3,4,5)P3 (fosfatidilinositolo(3,4,5)-trifosfato) e, in minor misura, da PtdIns(3,4)P2 (fosfatidilinositolo(3,4)-bifosfato) prodotti da PI3K (fosfatidilinositolo-3-chinasi). L’interazione del PtdIns(3,4,5)P3 con il dominio PH di Akt promuove la traslocazione di Akt sulla membrana plasmatica. Una volta attivata, la cascata di Akt coinvolge numerosi substrati, ognuno dei quali presenta un ruolo specifico sulla funzionalità cellulare.

fattore oncosoppressore che limita la fosforilazione di Akt e la sua conseguente attivazione. L’iperattivazione di Akt potrebbe essere una conseguenza anche della perdita della funzionalità di PTEN, con conseguenti effetti sulla proliferazione e apoptosi cellulare, nonché sulla migrazione ed invasione tumorale.

Su questa base Akt può essere considerato un ottimo bersaglio terapeutico per la progettazione e la sintesi di nuovi agenti apoptotici. Inibitori di tale enzima potrebbero infatti risultare efficaci come agenti antitumorali sia da soli che in combinazione con chemioterapici standard e/o radioterapia. E' stato infatti dimostrato che trattamenti di questo tipo rappresentano terapie antineoplastiche più efficaci rispetto alla terapia convenzionale [13].

La comprensione dei meccanismi biochimici dei processi di crescita e sviluppo cellulare e la progettazione di piccoli inibitori di Akt ha evidenziato il ruolo fondamentale del pathway PDK1 e Akt nel processo di carcinogenesi.

Fig.2: Blocco del pathway attraverso inibitori di Akt.

Negli ultimi anni sono state progettate e sintetizzate molecole capaci di interagire con differenti bersagli farmacologici presenti in questo complesso sistema di trasduzione del segnale. In particolare sono stati sintetizzati derivati che presentano come target specifico le chinasi PI3K, PDK1 e Akt.

Per quanto riguarda Akt, gli inibitori possono essere classificati in: a) inibitori del sito chinasico;

c) inibitori allosterici.

a) Gli inibitori del sito chinasico interagiscono con la tasca di legame ATPasica dell’enzima. La maggior parte dei composti appartenenti a questa classe sono inibitori competitivi dell'ATP che presentano bassa specificità, correlabile all’alto grado di omologia del sito di legame dell’ATP con le altre chinasi.

b) Gli inibitori dell’attivazione di Akt o inibitori del domino PH impediscono l’interazione di Akt con la membrana plasmatica ostacolandone l’attivazione. Anche questa classe manca di specificità a causa della presenza del dominio PH in altre chinasi (es. PDK1). Questi inibitori inoltre presentano una scarsa biodisponibilità a causa della loro elevata lipofilia.

L’unico farmaco di questa classe attualmente in fase clinica (fase III) è la perifosina, un composto di struttura alchilfosfolipidica che presenta un buon profilo farmacologico [44]. perifosina N+ O P O OH O C₁₈H₃₇ C H₃ CH₃

Fig.3: Struttura della perifosina

c) Gli inibitori di tipo allosterico interagiscono con Akt stabilizzandone la forma “chiusa” che non può essere attivata da PDK1. Questa classe di composti mostra alti livelli di specificità rispetto alle altre chinasi e alle diverse isoforme di Akt.

Fig.4: Strutture di due inibitori allosterici

N N H N N NH O Me O N N H N N NH O Me Me Me

Tenendo presente la complessità biologica alla base della genesi e della progressione della patologia tumorale, sono state progettate molecole multifunzionali capaci di interagire con diversi bersagli costituenti il pathway stesso. Questo tipo di strategia farmaceutica si è dimostrata efficace in numerose patologie ad eziologia complessa quale quella cardiovascolare. L’applicazione di questa strategia sintetica nella progettazione di nuovi inibitori del pathway potrebbe garantire una maggiore efficacia.

Un’analisi strutturale di ligandi capaci di interagire con questo pathway ha permesso di evidenziare come il core 2-oxo-indolico rappresenti un gruppo farmacoforico comune a numerosi inibitori di Akt.

Tra i derivati che presentano tale nucleo, il composto BX-517 è risultato un inibitore efficiente in vitro sia nei confronti di PDK1, con IC50 di 0.52 µM, che di Akt, con valori

di IC50 nel range del micromolare [48].

N H O N H NH O N H₂

BX-517

Benchè BX-517 abbia un buon profilo di attività, questa molecola presenta grossi problemi di ADME (assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione) come breve emivita, bassa stabilità metabolica, scarsa solubilità in ambienti acquosi [48].

Negli ultimi anni sono stati pubblicati numerosi brevetti sulla sintesi di nuovi ligandi inibitori del pathway di Akt. Un’analisi dei gruppi farmacoforici presenti su tali derivati ha permesso di evidenziare analogie strutturali che hanno confermato l’importanza del nucleo centrale 2-oxindolico.

Fig.6: Struttura generale dei derivati 2-oxo-indolici derivante dallo studio di composti recentemente brevettati

Con lo scopo di sintetizzare nuovi inibitori “duali” PDK1/Akt dotati di migliori proprietà farmacocinetiche rispetto a BX-517, nel laboratorio dove ho svolto il lavoro di tesi erano stati sintetizzati composti alchilammidici di struttura generale B.

Prendendo come modelli di riferimento la struttura del composto BX-517, che possiede un nucleo indolonico, e quella dei composti recentemente brevettati, che presentano vari nuclei eteroaromatici legati al core centrale (posizione 3 e 5 dell’oxindolo), sono stati sintetizzati nuovi derivati indolonici di tipo B. In questi composti il sostituente in posizione 3 è un anello eterociclico (tiofene, imidazolo, metil-imidazolo) mentre in posizione 5 sono presenti differenti gruppi arilalchilammidici.

O NH N H O N MeO MeO Eterociclo B

Fig.7: Struttura generale B e strutture dei derivati G24 e G31.

Tali composti, testati su linee cellulari di cancro al polmone A549 (carcinoma broncoalveolare umano) e HCC827 (adenocarcinoma polmonare umano) hanno dimostrato di:

 ridurre la fosforilazione della Thr308 e la Ser473, necessarie per l'attivazione di Akt;

 interferire con il ciclo cellulare nelle cellule tumorali attraverso il blocco in fase G1, causando così un aumento della concentrazione di cellule in fase quiescente;

 possedere, inoltre, interessanti proprietà citotossiche e proapoptotiche.

Su questa base, in questa tesi, sono stati progettati e sintetizzati composti con struttura indolonica di formula generale A, variamente funzionalizzati in posizione 3 e 5, con lo scopo di ampliare lo studio dei rapporti struttura-attività di questi derivati.

R

N H

O

Eterociclo

Fig.8: Struttura generale del 2-oxi-indolo 3-5-disostituito.

Questi composti differiscono dai derivati indolonici precedentemente sintetizzati (struttura generale B) per il tipo di sostituente in posizione 5.

La catena alchilammidica è stata sostituita con un raggruppamento di tipo

N H NH O N MeO MeO O N N H Me G31 N H NH O N MeO MeO O S H G24

metilenamminosolfonico come nei composti 1 a-c o metilchetonico come nei composti 2 a-c.

Il sostituente in posizione 3 è costituito da un sistema eterociclico aromatico (tiofene, 2-imidazolo, N- metil-5 imidazolo).

O NH N H O N MeO MeO Eterociclo B N S N H O MeO MeO O H O H N N Me 1c 2c Me N H O H O N MeO MeO N N N S N H O MeO MeO O H O H S 1a N H O H O N MeO MeO S 2a N H O H O N MeO MeO N N H 2b N S N H O MeO MeO O H O H N N H 1b

OH O NO₂ N H O N H O S O O Cl N S N H O MeO MeO O H O Ar N S N H O MeO MeO O H O I II III IV 3 4 6 1a-c

+

Reagenti e condizioni: I: Fe, AcOH glaciale, riflusso, 12 h; II: ClSO2OH, r.t., 1.5h, 68°C, 1h;

III: 3,4-dimetossi-benzilammina EtOH, r.t., 4 h;

IV: Aldeide appropriata, EtOH assoluto, piperidina, 110°C, 12 h.

a B c

Le solfonammidi 1a-c sono state sintetizzate seguendo la procedura descritta nello schema 1.

Il composto 3 (2-oxindolo) è stato ottenuto dall' acido 2-nitro-fenilacetico commerciale attraverso una reazione di ciclizzazione riduttiva in presenza di AcOH glaciale e ferro elementare. Il derivato aromatico 3 è stato funzionalizzato in posizione 5 per reazione con l’acido clorosolfonico commerciale, per fornire il corrispondente clorosolfonilderivato 4. . Il derivato solfonammidico 6 è stato quindi ottenuto tramite reazione del solfonilcloruro 4 con la 3,4-dimetossi-benzilammina commerciale.

La successiva reazione di condensazione del derivato solfonammidico 6 con l’appropriata aldeide eterociclica aromatica (2-tiofencarbossialdeide, imidazolo-5-carbossialdeide e l’1-metil-2-imidazolo-imidazolo-5-carbossialdeide) in EtOH assoluto e in presenza di una quantità catalitica di piperidina, ha condotto ai prodotti finali corrispondenti 1a-c. Dalla reazione di condensazione delle aldeidi aromatiche con i derivati indolonici (6) si ottiene esclusivamente la formazione di un solo isomero. Dall’analisi dei dati di NMR si può affermare che l’isomero ottenuto per i derivati 1a e 1b è l’isomero Z e che per il derivato 1c è l’isomero E. Tale risultato si evidenzia dai valori di chemical shift dei segnali del protone in posizione 4 dell’indolone. L’isomero Z presenta valori di chemical shift compresi nell’intervallo 7.70-8.40 ppm, mentre nell’isomero E il chemical shift assume valori superiori di 1 ppm a campi più bassi rispetto all’intervallo indicato. Anche il segnale del CH vinilico rappresenta un segnale diagnostico che, nell’isomero Z, è compreso nell’intervallo di chemical shift di 7.50-8.30 ppm, mentre nell’isomero E si ha una variazione di 0.30-0.70 ppm a campi più alti dall’intervallo indicato. Questi risultati sono in accordo con quanto riportato in letteratura per analoghe strutture di uguale configurazione [49].

N H O N H O O Cl Ar I II III 3 9a-c N H O Cl O 8 N H O Ar O N MeO MeO 2a-c NH HCl MeO MeO

+

+

Reagenti e condizioni: I: AlCl3, CH2Cl2, 0°C, ClCH2COCl, 15 min, 45°C, 2h;

II: Aldeide appropriata, EtOH assoluto, piperidina, 110°C, 12 h; III: 6,7-Dimetossitetraidroisochinolina, K2CO3, CH2Cl2/MeOH

9:1, 59°C, 48 h.

a b c

I derivati carbonilici 2 a-c sono stati ottenuti seguendo la procedura descritta nello schema 2.

Il composto 3 è stato sottoposto a reazione di Friedel Craft per funzionalizzare la posizione 5, utilizzando AlCl3 e 2-cloroacetilcloruro commerciale 7. La successiva

reazione di condensazione dell’intermedio 8 rispettivamente con l’appropriata aldeide (2-tiofencarbossialdeide, imidazolo-5-carbossialdeide, 1-metil-2-imidazolo-carbossialdeide) in EtOH assoluto e in presenza di una quantità catalitica di piperidina, ha condotto agli intermedi corrispondenti 9a-c.

Dalla reazione di condensazione delle aldeidi aromatiche con i derivati indolonici (8) è stata ottenuta esclusivamente la formazione di un solo isomero. Dall’analisi dei dati di NMR è stato possibile affermare che l’isomero ottenuto per i derivati 9a e 9b è l’isomero Z e che per il derivato 9c è l’isomero E. Tale risultato si evidenzia dai valori di chemical shift dei segnali del protone in posizione 4 dell’indolone. L’isomero Z presenta valori di chemical shift compresi nell’intervallo 7.70-8.40 ppm, mentre nell’isomero E il chemical shift assume valori superiori di 1 ppm a campi più bassi rispetto all’intervallo indicato. Anche il segnale del CH vinilico rappresenta un valore diagnostico che, nell’isomero Z, è compreso nell’intervallo di chemical shift di 7.50-8.30 ppm, mentre nell’isomero E si ha una variazione di 0.30-0.70 ppm a campi più alti dall’intervallo indicato. Questi risultati sono in accordo con quanto riportato in letteratura per analoghe strutture di uguale configurazione [49].

Il cloroacetil derivato 9a-c è stato sottoposto a reazione di alchilazione con la 6,7-dimetossitetraidroisochinolina commerciale 10 in presenza di K2CO3, fornendo i

prodotti finali 2a-c.

I composti sintetizzati sono attualmente in fase di sperimentazione per valutarne l’attività inibitoria nei confronti di Akt e PDK1 e di conseguenza l’ effetto inibitorio sulla proliferazione cellulare, apoptosi e fosforilazione di Akt, da soli o in combinazione con chemio e radioterapia. I dati relativi a questa sperimentazione non sono attualmente disponibili.