CAPITOLO 6
DISCUSSIONE
Dai risultati ottenuti si può rilevare quanto segue:
- le Metodiche in HPLC utilizzate per la determinazione del α-Tocoferolo, Coenzima Q10 e dei dipeptidi istidinici e della l-istidina sono state parzialmente modificate
rispetto a quelle descritte in letteratura. Tali modifiche hanno consentito di realizzare, per gli antiossidanti lipofili, una metodica che ha permesso di effettuare una estrazione unica dell’ α-Tocoferolo e del Coenzima Q10 riducendo significativamente
i tempi di lavoro. Per quanto concerne la determinazione quantitativa dei dipeptidi istidinici sono state apportate modifiche alle metodologie riportate in letteratura relativamente alla separazione effettuata con metodica HPLC che è stata eseguita in condizioni isocratiche e con variazioni apportate alla fase mobile. Una ulteriore modifica è stata quella di eseguire la derivatizzazione dei dipeptidi post colonna con OPA alla temperatura costante di 30°C e ciò ha consentito di poter aumentare significativamente la sensibilità in termini quantitativi potendo rilevare concentrazioni dell’ordine di 10-9 g.
- I livelli di concentrazione del Coenzima Q10 intraspermatico hanno mostrato una
notevole variabilità tra i singoli soggetti attestandosi su valori intorno a 2 nmoli/109 spz e risultando leggermente inferiori rispetto al contenuto di CoQ10 negli
- spermatozoi di piccione e di gran lunga superiori rispetto al Coenzima Q10 negli
spermatozoi di coniglio (Gazzano e coll., 2003).
- Anche la concentrazione dell’α-tocoferolo negli spermatozoi di cavallo ha mostrato una notevole variabilità tra i soggetti con valori inferiori a quelli rilevati nel coniglio dimostrando una diversa presenza dei due antiossidanti negli spermatozoi in queste specie animali probabilmente dovuta alla presenza di α-tocoferolo nei mangimi utilizzati per la specie cunicola.
- Le varie correlazioni effettuate tra questi due antiossidanti lipofili e le principali caratteristiche seminali non hanno mostrato alcuna significatività sia rispetto ai parametri di motilità che di morfologia nonché ai test di integrità della membrana della testa dello spermatozoo (EOS-Nigrosina Test; HOS-Test). Ciò probabilmente può essere dovuto al ridotto numero di campioni analizzati ed alla notevole variabilità individuale nonché alla determinazione totale dei due composti che sono presenti sia nella forma ossidata che in quella ridotta. Ciò a maggior ragione per quanto riguarda il Coenzima Q10 che funziona da agente riducente dell’ α-tocoferolo
che dovrebbe avere la maggiore attività antiossidante a livello di membrana (Gazzano e coll., 2003).
- In questa tesi si è stata dimostrata per la prima volta la presenza dei dipeptidi istidinici nel seme fresco di cavallo; infatti non esiste alcuno studio in letteratura riguardante la loro presenza in questa matrice biologica sia nell’uomo che nelle varie
Le loro concentrazioni intraspermatiche si sono attestate su valori dell’ordine delle nanomoli/109 spz per la Carnosina mentre per la l-Istidina i livelli sono risultati essere di gran lunga superiori (µmoli/109 spz). L’altro dipeptide, l'Anserina non era rilevabile quantitativamente all’interno degli spermatozoi mentre la sua concentrazione nel plasma seminale mostrava livelli dell’ordine delle decine di nanomoli/ml.
- La Carnosina era presente anche nel plasma seminale con valori nettamente inferiori a quelli della l-Istidina che erano dell’ordine delle centinaia di nanomoli/ml. Questi dati dimostrano una diversa localizzazione dei due dipeptidi nell’eiaculato ed una elevata concentrazione di l-Istidina sia negli spermatozoi che nel plasma seminale. La loro presenza può risultare molto importante in quanto tutte queste molecole esercitano una attività antiossidante ed un marcato effetto tampone ritardando l’abbassamento del pH dovuto al metabolismo cellulare (Quinn e coll.,1992).
I nostri risultati hanno evidenziato una correlazione positiva e significativa della carnosina rispetto al parametri di motilità quali: % motilità progressiva, % motilità totale, velocità media (VAP), velocità lineare (VSL).
In aggiunta, la presenza di questi composti antiossidanti idrosolubili sembra essere di gran lunga superiore in termini quantitativi rispetto al Coenzima Q10 (circa 40volte
più elevata) ed all’α-tocoferolo (da un minimo di 30 ad un massimo di 150 volte).
Tale differenza risulta notevolmente amplificata rispetto al confronto dei due antiossidanti liposolubili con le concentrazioni della l-Istidina.
Da questi primi risultati ottenuti sul seme fresco di cavallo appare molto interessante la correlazione tra carnosina intraspermatica ed i parametri di motilità,
facendo supporre un suo attivo coinvolgimento nella attività antiossidante e tampone. Infatti quest’ultima risulta importante nel ritardare l’abbassamento del pH durante l’osservazione del seme fresco, fenomeno che porta ad una riduzione della motilità degli spermatozoi. Potrebbe quindi essere utile valutare l’aggiunta di questa molecola al seme fresco in modo da ritardare l'abbassamento del pH con un conseguente effetto positivo sui parametri di motilità.
Inoltre con una campionatura più ampia potrebbero essere rilevate ulteriori correlazioni di queste molecole antiossidanti con le altre caratteristiche seminali ed eventuali correlazioni significative delle forme ossidate e ridotte del coenzima Q10 e
dell’α-tocoferolo con i più importanti parametri seminali, valutandone il loro possibile ruolo come “marker di fertilità”.
CONCLUSIONI
In conclusione si può affermare che:
1) gli spermatozoi sono cellule intensamente ossido-riducenti con una elevata produzione di specie reattive ossigenate.
2) I meccanismi che regolano il sistema ossido-riduttivo degli spermatozoi non sono ancora del tutto chiari soprattutto per quanto riguarda il ruolo delle specie reattive ossigenate (ROS).
3) Risulta invece ormai consolidato che la funzionalità degli spermatozoi si basa su un delicato equilibrio tra sostanze antiossidanti e ROS.
4) Da vari studi riportati in letteratura emerge anche che le ROS svolgono un ruolo importante dal punto di vista fisiologico regolando alcuni aspetti della vita dello spermatozoo come la motilità, la capacitazione, la reazione acrosomiale e la fusione con la cellula uovo.
5) La nostra ricerca ha evidenziato l’esistenza di una correlazione positiva tra i livelli seminali di carnosina e la qualità del seme equino e può quindi risultarne utile la valutazione e l’eventuale addizione al seme per migliorarne la sopravvivenza ed il potere fecondante.
