3.1 Prove preliminari

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3. RISULTATI

3.1 Prove preliminari

In questo paragrafo sono riportati i risultati delle prove effettuate nel primo periodo di tesi che, sebbene limitate come replicazione spazio-temporale, hanno fornito alcune utili indicazioni riguardo ai materiali, i metodi e i siti campione da utilizzare per il successivo confronto tra saggi di embriotossicità in situ e in laboratorio.

3.1.1 Prova dei materiali

I risultati dei saggi di embriotossicità (Fig. 3.1), allestiti con piastre sterili (n=6) e utilizzando la sonda biologica (n=12) (§ 2.4.1), confrontati mediante un test t, hanno manifestato valori confrontabili tra i due test (t = 1.133, 16 g.l., P>0.05), a dimostrazione che non vi sono differenze dovute alla natura delle camere d’esposizione dove viene condotto il saggio.

Fig. 3.1 – Saggio di embriotossicità: confronto delle percentuali medie di sviluppo larvale (±ES) ottenute su piastre sterili e utilizzando la sonda biologica.

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3.1.2 Prove in situ-laboratorio

Prima prova (12 maggio 2010)

Nel test in situ è stato recuperato il materiale solo in due stazioni sulle tre considerate; le camere poste nel sito di controllo non sono state recuperate al termine delle 72 h a causa delle avverse condizioni meteo-marine e quindi i dati relativi a questa stazione (L3) non sono disponibili. Inoltre le camere a due aperture, in ogni stazione, sono state casualmente danneggiate da ignoti.

Dopo 72 ore i plutei presenti nei campioni delle stazioni portuali (L1 e L2) hanno mostrato evidenti malformazioni (Fig. 3.2); i valori delle barre delle prove in situ corrispondono al valore medio di tutte le repliche con le differenti camere test. I risultati delle prove hanno fornito inoltre dati confrontabili con quelli ottenuti in laboratorio (Tab. 3.1). I risultati sono stati esaminati con un’ANOVA univariata che ha confrontato le varianze di tutte le condizioni sperimentali per tutti i siti.

Le 2 tipologie di camera test non hanno dato, ad esclusione di un caso, risultati significativamente differenti tra loro e rispetto ai saggi eseguiti in laboratorio. Da un punto di vista qualitativo le letture al microscopio sono risultate più complesse nelle camere a 3 aperture a causa dell’elevata quantità di materiale particellato entrato nelle camere durante il periodo d’esposizione.

Fig. 3.2 – Saggio di embriotossicità: confronto delle percentuali medie di sviluppo larvale (±ES, n = 3) in condizioni di laboratorio e in situ.

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Tab. 3.1 – Confronto tra dati di laboratorio e in situ, e tra le diverse tipologie di camera in tutti i siti.

Campione % Plutei SD P

L1 Lab 13,33 2,08

> 0,05

L1 in situ 1 aperura 11,33 2,52

L1 Lab 13,33 2,08

> 0,05

L1 in situ 3 aperture 8 2,65

L1 in situ 1 apertura 11,33 2,52

> 0,05

L1 in situ 3 aperture 8 2,65

L2 lab 23,33 1,53

> 0,05

L2 in situ 1 apertura 23 4,58

L2 lab 23,33 1,53

< 0,05*

L2 in situ 3 aperture 16,67 2,52

L2 in situ 1 apertura 23 4,58

> 0,05 L2 in situ 3 aperture 16,67 2,52

Seconda prova (18 novembre 2010)

I risultati hanno mostrato livelli di contaminazione estremamente elevate in L1 e L2, con assenza di plueti normoformati (Fig. 3.3) sia in situ che in laboratorio. Per quanto riguarda il nuovo sito scelto come controllo (L4) il test di laboratorio mostra percentuali di plutei normoformati più elevate rispetto agli altri 2 siti portuali (62.6%), ma tuttavia inferiori al valore soglia previsto dal protocollo del saggio in laboratorio per considerare le acque del sito come controllo negativo (70%). I dati rilevati in situ sono più bassi (26,3%) e differiscono significativamente da quelli di laboratorio (t = -6,259, 10 g.l., P = 0,000 <0,05). In questo caso, come osservato nella prima prova, le camere con 2 e 3 aperture hanno mostrato al loro interno, in tutti i siti, evidenti quantità di materiale particellato, tale da rendere molto difficoltosa la lettura al microscopio. Nonostante questa osservazione è stato comunque eseguito un confronto tra le diverse tipologie di camera che non ha evidenziato differenze significative (Tab. 3.2)

Tabella 3.2 – ANOVA a una via sugli effetti dei diversi livelli (camere a 1-3 aperture) del fattore tipologia di camera.

Sorgente di variabilità Devianza g.l. MS F P

Tra tipologie di camera 104,59 2 52,30 0,63 > 0,05

Entro tipologia 495,53 6 82,59

Totale 600,12 8

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Terza prova (29 novembre 2010)

I siti L1 e L2 si sono confermati fortemente contaminati, sia in laboratorio che in situ, con il blocco dello sviluppo di tutti gli embrioni a fasi precedenti al pluteo 4 braccia (Fig. 3.4). Il controllo di laboratorio è risultato nella norma con valori superiori al 70%. Utilizzando la rete da 55 μm si osserva una buona riduzione del particellato all’interno delle camere, in particolare per quelle ad una sola apertura. Le avverse condizioni meteo-marine non hanno consentito il recupero nel nuovo sito di controllo (L5), individuato nell’area di prelievo degli organismi.

Quarta prova (13 dicembre 2010)

Il saggio ha confermato i risultati ottenuti durante le prove precedenti, con forte contaminazione delle stazioni portuali (L1 e L2). In questa prova l’acqua del controllo di laboratorio ha mostrato un’elevata tossicità, probabilmente per le condizioni meteo-marine perturbate il giorno in cui è stata prelevata. Il terzo sito scelto come ulteriore sito di controllo (L5), si è rivelato meno contaminato delle stazioni portuali, con percentuale di plutei normoformati più alta in laboratorio (52%) rispetto alle prove in situ, che hanno mostrato una tossicità paragonabile e quella delle aree portuali (Fig.

3.5). Anche in questo caso le letture sono risultate molto più agevoli nelle camere ad un’apertura e rete di 55 μm.

Fig. 3.3 – Saggio di embriotossicità: confronto delle percentuali medie di sviluppo larvale (±ES, n = 3) in condizioni di laboratorio e in situ.

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3.1.3 Prove a diverse temperature

I risultati sono riportati in tabella 3.3 e in figura 3.6. Essi hanno mostrato un raggiungimento dello stadio di pluteo 4 braccia superiore (o uguale) al 70% e inferiore (o uguale) al 90% a tutte le temperature, dopo tempi diversi. In particolare, dalle 7 prove effettuate emerge che: a 13°C il tempo medio impiegato è compreso tra 96 e 120 h, a 18°C tra 48 e 72 h e a 24°C tra 24 e 48 h, ricordando che le osservazioni sono state eseguite ad intervalli di 24 h.

Tabella 3.3 – Percentuali medie di plutei a 4 braccia normoformati in funzione della temperatura e della durata di esposizione (ad intervalli di 24h) . I valori evidenziati sono quelli con embrioni normoformati in percentuale uguale o superiore al 70%.

Tempo d'esposizione (h)

Prova Temperatura (°C)

24 48 72 96 120

I

13 0 0 0 51 81

18 0 57 85

24 0 85,3

II

13 0 0 41 81,6

18 0 73

24 0 90

III

13 0 0 30,6 77,3

18 0 72,6

24 0 81,6

IV

13 0 0 62,6 90

18 0 44 86,3

24 0 78

V

13 0 0 0 59 83

18 0 49,6 91

24 0 86,3

VI

13 0 0 35 79

18 0 67,6 86,6

24 0 91

VII

13 0 0 42,6 82

18 0 67 87

24 0 84,6

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3.2 Prove definitive

Vengono riportati i risultati delle prove effettuate nel secondo periodo di tesi al fine di confrontare i saggi di embriotossicità in situ e in laboratorio, nei siti selezionati al termine delle prove preliminari.

25 Gennaio 2011

Tutti saggi condotti in laboratorio appaiono confrontabili con il controllo (Tab. 3.3) e mostrano valori ampiamente superiori al 70 % (Fig. 3.7). Per quanto riguarda i saggi in situ solo il sito di controllo S3 mostra valori confrontabili, mentre S1 e S2 differiscono in modo significativo dal controllo di laboratorio (Tab. 3.3). Per quanto riguarda le percentuali di sviluppo ottenute in situ si riscontrano valori minori rispetto ai dati di laboratorio nel caso di S1 e S2. S3 mostra invece valori superiori a tale soglia e confrontabili con la medesima prova eseguita in laboratorio.

Tabella 3.4 - Nella Parte I viene riportato il confronto tra il “Controllo” di laboratorio e i dati ottenuti sia in “situ” che in laboratorio “Lab” per tutti i siti. Nella Parte II della tabella vengono fornite informazioni relative al confronto laboratorio-situ per ogni sito.

Campione Media DS n t P

Controllo 88,33333 PARTE I

3,7859389 3

S1 Situ 41,66667 38,0164438 9 -3,62903 < 0,01**

S2 Situ 22 22,5997788 9 -8,45661 < 0,01**

S3 Situ 85,71429 4,57217256 7 -0,93993 > 0,05 S1 Lab 87 3,464102 3 -0,45004 > 0,05 S2 Lab 87,66667 3,05505 3 -0,23736 > 0,05 S3 Lab 89,66667 1,527525 3 0,565685 > 0,05

S1 Lab 88,33333

PARTE II

3,7859389 3

S1 Situ 41,66667 38,0164438 9 -3,62903 < 0,01**

S2 Lab 88,33333 3,7859389 3

S2 Situ 22 22,5997788 9 -8,45661 < 0,01**

S3 Lab 88,33333 3,7859389 3

S3 Situ 85,71429 4,57217256 7 -0,93993 > 0,05

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15 Febbraio 2011

Come nella data precedente (Tab. 3.4) tutti i saggi di laboratorio non differiscono significativamente dal controllo. Il saggio in situ condotto in S1 mostra un valore significativamente più basso del controllo, mentre il sito di controllo S3 risulta significativamente più alto.

Per quanto riguarda i saggi in situ, S2 non mostra differenze significative con la prova di laboratorio; S1 mostra invece differenze molto significative: il dato di campo è peggiore del dato di laboratorio. In S3 il dato di campo è invece migliore del dato di laboratorio; quest’ultimo mostra comunque una percentuale di embrioni normoformati superiore al 70% (Fig. 3.8).

I risultati di laboratorio mostrano valori sopra la soglia del 70% a eccezione di S2 (66%).

Fig. 3.7 – Percentuale di embrioni normoformati (media ± ES) in condizioni di laboratorio e in situ. Gli asterischi indicano differenze significative (* P < 0.5; ** P < 0.01) tra controllo e campioni.

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Tabella 3.5 - Nella Parte I viene riportato il confronto tra il “Controllo” di laboratorio e i dati ottenuti sia in “situ” che in laboratorio “Lab” per tutti i siti. Nella Parte II della tabella vengono fornite informazioni relative al confronto laboratorio-situ per ogni sito.

Controllo 73,66667

PARTE I

4,50925 3

S1 Situ 45,66667 24,67286 9 -3,24581 < 0,05*

S2 Situ 72,66667 14,68843 9 -0,18033 > 0,05 S3 Situ 88,5 2,50998 6 5,301753 < 0,05*

S1 Lab 72,33333 2,081666 3 -0,46499 > 0,05

S2 Lab 66 5 3 -1,97223 > 0,05 S3 Lab 73,66667 4,50925 3 0 > 0,05

S1Lab 72,33333 PARTE II

2,081666 3

S1 Situ 45,66667 24,67286 9 -3,20835 <0,01**

S2 Lab 66 5 3

S2 Situ 72,66667 14,68843 9 1,172925 > 0,05 S3 Lab 73,66667 4,50925 3

S3 Situ 88,5 2,50998 6 5,301753 <0,05*

21 Febbraio 2011

I saggi di laboratorio non differiscono significativamente dal controllo, ad eccezione del campione S2, che risulta comunque significativamente maggiore. I saggi in situ, (S1, S2 e il sito di controllo S3), risultano significativamente minori del controllo: S1 e S2, con percentuali di embrioni normoformati nettamente inferiori al 70%, S3 con una percentuale comunque

superiore (74,6%).

Il confronto tra le prove in laboratorio e in campo, evidenzia differenze altamente significative tra

tutte le stazioni analizzate.

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Lab 90,66667 PARTE I

1,527525 3

S1 Situ 8,444444 15,59736 9 -15,5919 < 0,01**

S2 Situ 14,66667 18,86796 9 -11,9669 < 0,01**

S3 Situ 74,57143 8,482475 7 -4,84044 < 0,01**

S1 Lab 86 3,605551 3 -2,06419 > 0,05 S2 Lab 86,66667 1,154701 3 -3,61814 < 0,05*

S3 Lab 90 1 3 -0,63246 > 0,05

S1Lab 92,66667 PARTE II

2,516611 3

S1 Situ 8,444444 15,59736 9 -15,6015 < 0,01**

S2 Lab 93,33333 4,618802 3

S2 Situ 14,66667 18,86796 9 -11,5156 < 0,01**

S3 Lab 90,66667 1,527525 3

Fig. 3.8 – Percentuale di embrioni normoformati (media ± ES) in condizioni di laboratorio e in situ. Gli asterischi indicano differenze significative (* P < 0.5; ** P < 0.01) tra controllo e campioni.

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07 Marzo 2011

Anche in questa ultima prova, tutti i saggi di laboratorio non differiscono significativamente dal controllo. Come nel caso precedente i saggi in situ, (S1, S2 e il sito di controllo S3), risultano significativamente minori del controllo: S1 e S2, con percentuali di embrioni normoformati nettamente inferiori al 70%, S3 con una percentuale comunque superiore (70,6).

Il confronto tra le prove in laboratorio e in campo, evidenzia differenze altamente significative tra tutte le stazioni analizzate. Da segnalare il dato in situ della stazione S2 che mostra un’ assenza di embrioni normoformati.

Fig. 3.8 – Percentuale di embrioni normoformati (media ± ES) in condizioni di laboratorio e in situ. Gli asterischi indicano differenze significative (* P < 0.5;

** P < 0.01) tra controllo e campioni.

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Media DS n t P

Controllo 85,333

PARTE I

0,57 3

S1 Situ 34,25 11,997 8 -12,006

< 0,01**

S2 Situ 0 0 7 -256

< 0,01**

S3 Situ 70,571 2,507 7 -14,695

< 0,01**

S1 Lab 87,666 3,213 3 1,237

^{> 0,05}

S2 Lab 84,333 8,144 3 -0,212

^{> 0,05}

S3 Lab 85,333 0,577 3 0

^{> 0,05}

S1 Lab 87,666

PARTE II

3,214 3

S1 Situ 34,25 11,997 8 -11,537 < 0,01**

S2 Lab 84,333 8,144 3

S2 Situ 0 0 7 -17,934 < 0,01**

S3 Lab 85,333 0,577 3

S3 Situ 70,571 2,5071 7 -14,695 < 0,01**

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In Fig. 3.11 sono riportati per ciascun sito i valori di campo e i valori di laboratorio mediati su tutte le 4 date di campionamento. Dall’istogramma si osserva che i valori medi sono più bassi nei saggi condotti in situ rispetto a quelli di laboratorio. Tuttavia si nota anche che, a differenza di S1 e S2, S3 presenta una media comunque superiore alla soglia del 70%, confermandosi come sito di controllo in mare e dimostrandosi la stazione che concorda maggiormente con i dati di laboratorio.

Fig. 3.11 – Saggio di embriotossicità: confronto delle percentuali di sviluppo larvale mediate su tutte le date di campionamento (±ES) in condizioni di laboratorio e in situ.

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Prove di EC50 con i gameti utilizzati in situ

I risultati dei test di spermiotossicità, dopo l’eventuale stress dovuto al trasporto dei gameti in campo, sono riportati in figura 3.11.

Parametri chimico-fisici della colonna d’acqua

I valori di temperatura, pH, salinità e ossigeno disciolto sono riportati nella tabella 3.6.

Tabella 3.8 – Valori medi dei parametri chimico-fisici osservati in ogni data per tutti i siti

PARAMETRI SITO DATA T (°C) S (‰) pH O2

(% saturazione)

Solidi sospesi (mg/l)

S1 25/01/2011 12,1 36 8,4 75,2 -

15/02/2011 11,8 38 8,3 83,4 - 21/02/2011 13,9 38,5 8,5 86,8 - 07/03/2011 12,8 39 8,4 88,3 4,6

S2 25/01/2011 12,9 39 8,3 101,3 -

15/02/2011 13,2 38 8,3 104,2 - 21/02/2011 13,4 38 8,4 102,5 - 07/03/2011 13,2 38,5 8,5 106,1 3,9

S3 25/01/2011 13,1 39 8,3 103,6 -

15/02/2011 13,3 38 8,3 110,3 - 21/02/2011 13,2 38,5 8,4 107,4 -

Fig. 3.12 –Valori di EC50 ottenuti nel corso degli esperimenti condotti.

Le due linee orizzontali individuano l’intervallo di accettabilità (21,69–

68,18 µg/l).

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Analisi chimiche della colonna d’acqua

Le acque campionate in data 07.03.2011 sono state utilizzate, oltre che al saggio di laboratorio, anche a indagini chimiche (Tab. 3.7).

Tabella 3.9 – Risultati analitici per ciascun parametro chimico nei 3 siti indagati. n.r : non rilevato, indica un valore inferiore al limite di rilevabilità utilizzato dal metodo di analisi.

PARAMETRI (μg/l)

Metalli Idrocarburi totali (come n-esano)

SITO As Cd Cr Pb Cu Zn Dro Gro I. tot.

S1 4,23 n.r 0,435 0,614 5,20 7,8 n.r n.r n.r S2 4,27 n.r 0,163 0,216 n.r n.r n.r n.r n.r S3 4,04 n.r 0,745 0,101 n.r n.r n.r n.r n.r