Catalisi Enzimatica/Biotrasformazioni in Chimica Verde.

Catalisi Enzimatica/Biotrasformazioni in Chimica Verde.

Prof. Attilio Citterio

Dipartimento CMIC “Giulio Natta”

https://iscamapweb.chem.polimi.it/citterio/it/education/course-topics/

Scuola di Ingegneria Industriale e dell’Informazione Corso 096125 (095857)

Introduction to Green and Sustainable Chemistry

Definizioni.

• Biochimica

 Lo studio della chimica dei sistemi viventi

 Lo studio delle molecole biologiche

1. Come funzionano 2. Le loro strutture 3D

3. Come le loro funzioni si combinano per produrre un sistema vivente.

• Bioingegneria

 Un ampio settore che può includere le ingegnerie elettrica, meccanica, industriale, ambientale e chimica che operano su sistemi medici e agricoli (ingegneria biologica ha lo stesso

significato).

• Ingegneria Biomedica

 Come l’ingegneria biochimica si applica comunemente al settore medico.

Definizioni (2).

• Ingegneria Biochimica

 L’uso per scopi pratici di organismi viventi o di prodotti di sistemi biologici

 Ingegneria di processi che usano dei biocatalizzatori, materie prime bio-organiche e/o bio-assorbenti usando i principi dell’Ingegneria Chimica

• Biotecnologia

 Ogni tecnica che usa organismi viventi o sostanze da essi prodotte per fare o modificare un prodotto, per migliorare piante o animali, o per sviluppare microorganismi per specifici usi

 Comunemente implica l’uso o lo sviluppo di metodi di

manipolazione genetica per obiettivi d’interesse (ingegneria genetica o tecnologia del DNA ricombinante).

 L’uso di cellule o di componenti di animali, piante e microbi, per produrre sostanze o processi utili.

Definizioni (3).

Enzimi,

 Prodotti dagli organismi viventi, sono composti di natura proteica con proprietà catalitiche. Questi catalizzatori sono sia efficienti che altamente specifici per una particolare reazione chimica che implica la sintesi, la degradazione o l’alterazione di un composto. In queste reazioni, in cui le molecole sono ridotte, ossidate, trasposte o assemblate, sono spesso coinvolti dei cofattori. Alcuni enzimi sono modificati covalentemente per fosforilazione, glicosilazione ed altri processi.

subtilisin CPO phytase

Definizioni (4).

• Co-fattori

 composti non-proteici che si legano a una proteina e sono richiesti per l’attività biologica della proteina. I cofattori si possono considerare

"molecole di supporto" che assistono nelle trasformazioni biochimiche.

 I cofattori sono sia organici che inorganici. Si classificano in dipendenza della forza di legame con l’enzima, con quelli debolmente legati detti coenzimi e quelli saldamente legati detti gruppi prostetici. Un enzima

inattivo, senza cofattore è detto un apoenzima, mentre l’enzima completo con il cofattore è detto oloenzima.

 I coenzimi servono come trasportatori transienti di specifici gruppi funzionali

 Derivano spesso da vitamine (nutrienti organici essenziali in piccole quantità nella dieta).

Substrato

Coenzima

Cofattore (composto non proteico)

attivatore Apoenzima

(porzione proteica) inattivo

Oloenzima (enzima completo)

attivo

Cofattori e Coenzimi.

• Alcuni enzimi richiedono cofattori. Molto spesso ioni metallici.

• Coenzimi

 Molecole organiche

 Solubili

 Gruppi prostetici

• Apoenzimi vs. Oloenzimi.

Cys

Cys

Cys

Cys

S S

S S

Fe Fe S

S

[ 2Fe-2S ]

S

S

S

S Cys

Cys

Cys

Cys [ 4Fe-4S]

S S

S S

Fe Fe

Fe

Fe

Alcuni Cofattori.

Caratteristiche di Coenzimi Comuni.

Coenzima Reazione mediata Fonte vitamina Malattia associata

Biocitina Carbossilazione Biotina a

Coenzima A Trasferimento di Acile Pantotenato a

Coenzimi Cobalamina Alchilazione Cobalamina (B₁₂) Anemia Perniciosa Coenzimi Flavinici Ossido-riduzione Riboflavina (B₂) a

Acido Lipoico Trasferimento di Acile - a

Coenzimi Nicotinammide Ossido-riduzione Nicotinammide (niacina)

Pellagra Piridossal fosfato Trasferimento gruppo

Ammino

Piridossina (B₆) a Tetraidrofolato Trasferimento di gruppo a

1-carbonio

Acido Folico Anemia

megaloblastica Tiamina pirofosfato Trasferimento di Aldeide Tiamina (B₁) Beriberi

A Nessun nome specifico per la malattia umana, essendo rara o non osservata.

Biotecnologia.

• La manipolazione di geni è detta ingegneria genetica o tecnologia a DNA ricombinante.

• L’ingegneria genetica implica il prelievo di uno o più geni dalla porzione di DNA di un organismo e poi sia:

 Trasferirli in un altro organismo, o

 Rimetterli nello stesso organismo originale in combinazioni differenti

• Settori coinvolti

 biologia cellulare/molecolare

 microbiologia

 genetica

 anatomia e fisiologia

 biochimica

 ingegneria

 “computer science”

• Tipi di Biotecnologie

• Ricombinante, proteine R , DNA R.

• Organismi Geneticamente Modificati (GMO)

• Anticorpi (anticorpi monoclonali)

• Transgenica

• Terapia genica, Immunoterapia

• Rischi e vantaggi del biotech

Applicazioni delle Biotecnologie.

• Piante alimentari e organismi resistenti ai virus

• Mezzi diagnostici per rivelare malattie genetiche e malattie acquisite

• Terapie che usano i geni per curare le malattie

• Vaccini ricombinanti per prevenire le malattie.

• Composti chimici semplici o complessi (per esempio proteine) via over-espressione genica.

• Ausilio nel risolvere problemi ambientali.

Obiettivi della Biotecnologia.

• Comprendere meglio i processi dell’eredità e dell’espressione genica;

• Fornire una migliore comprensione e trattamento di varie malattie, particolarmente quelle dovute a disordini genetici;

• Generare ritorni economici, inclusi il miglioramento genetico di piante e animali per l’agricoltura e la produzione efficiente di molecole

biologiche utili.

Esempi:

 Riso ingegnerizzato per rafforzamento con Vitamina A

 Mais ingegnerizzato per resistere all’attacco di funghi

 Piante ingegnerizzate per resistere alla siccità

 Processo di bio-dilavamento che recupera metalli da depositi che non sono adeguati per il recupero a causa del loro basso

contenuto.

Sviluppo della Biotecnologia.

• Biotecnologia Antica - storia connessa al cibo-casa; Include la domesticazione

 Le popolazioni paleolitiche iniziano a stanziarsi e sviluppare società agricole circa 10,000 anni fa (siti agricoli in Asia, Europa e America)

 I primi coltivatori in medio oriente coltivavano grano, orzo e anche segale

 7,000 anni fa, dei pastori si spostavano nel Sahara con pecore, capre, bestiame e cercavano/usavano selci per preparare cibi

 I primi agricoltori arrivarono in Egitto 6,000 anni fa con bestiame, pecore, capre e sementi quali orzo, farro e ceci

 Cibi fermentati - 1500 BC (lieviti – succhi di frutta, vino, birra, pane, alcool;.

Gli egizi usavano il lievito 1500 BC. Il lievito da birra ind. risale al 1915-20)

• Biotecnologia Classica - costruita sull’antica biotecnologia; produzione di cibi e medicine promossa da Fermentazione

• Biotecnologia Moderna - manipola le informazioni genetiche in organismi; Ingegneria Genetica

Fermentazione.

• Processo microbico in cui avvengono trasformazioni di composti organici controllate da enzimi.

• La fermentazione è stata praticata da molto tempo e ha prodotto cibi quali il pane, il vino e la birra;

• 4000 - 9000 B.C. – La fermentazione del latte produsse lo Yogurt;

• 5000-9000 B.C. – Elaborazione del latte in Cina a produrre formaggio

• La pasta fermentata fu scoperta per caso quando dell’impasto non fu cotto immediatamente

• La moderna fabbricazione dei formaggi implica:

 inoculazione del latte con batteri produttori di acido lattico

 aggiunta di enzimi quali il caglio per precipitare la caseina

 riscaldamento

 separazione del siero dalla cagliata

 essicazione della cagliata

 salatura

 pressatura della cagliata

 maturazione.

Bevande Fermentate.

• La produzione della birra inizia già prima del 6000-5000 B.C.;

• Gli egizi ~5000 B.C facevano il vino dall’uva;

• Malto d’orzo – Lievito di birra trovato in antiche urne di terracotta;

• Monasteri - maggiori produttori di birra;

• 1680 - Leeuwenhoek osserva il lievito al microscopio;

• Tra il 1866 e il 1876 - Pasteur

stabilisce che I lieviti e altri microbi sono responsabili della

fermentazione.

Biotech Classica.

• Descrive lo sviluppo che la fermentazione ha avuto dai tempi antiche ai giorni nostri.

• Alta Fermentazione – sviluppata per prima, il lievito sta sopra

• 1833 - Fermentazione sommersa (o bassa) – il lievito sta sul fondo

• 1886 – Apparecchiature per fermentazioni realizzate da E.C. Hansen e ancora oggi usate

• I Guerra Mondiale – Fermentazione di solventi organici per esplosivi (glicerina)

• II Guerra Mondiale – bioreattori/fermentatori:

 Antibiotici

 Colesterolo – Steroidi

 Amminoacidi

 Grandi quantità di aceto si producono con l’Acetobacter su substrati di trucioli di legno

Succo di frutta fermentato

grata di legno

ingresso aria per ossidazione serpentine di raffreddamento

uscita del camera di

raccolta per l'aceto finito

trucioli di legno (coperti con uno strato di Acetbacter) scarico

Biotech Classica (2).

• Negli anni 1950, il colesterolo fu convertito in cortisone e ormoni

sessuali per idrossilazione microbica (inserimento di un gruppo -OH);

• Dalla metà degli anni 1950, si producono amminoacidi e altri

metaboliti primari (necessari alla crescita cellulare), ma anche enzimi e vitamine;

• Dagli anni 1960, si cominciarono a usare i microbi come fonti di

proteine e altre molecole dette metaboliti secondari (non necessari alla crescita cellulare).

Oggi per questa via si producono molti prodotti:

 Composti farmaceutici quali gli antibiotici

 Amminoacidi

 Molti composti chimici, ormoni e pigmenti

 Enzimi con un’ampia varietà di usi

 Biomassa per consumo commerciale e animale (quali proteine).

La Vecchia Biotech Incontra la Nuova.

• La fermentazione e l’ingegneria genetica sono state usate nella produzione di cibi fin dagli anni 1980

• Organismi geneticamente ingegnerizzati sono coltivati in fermentatori e sono modificati per produrre grandi quantità di enzimi utili, che

vengono estratti e purificati

• Si usano enzimi nella produzione del latte, formaggio, birra, vino, dolciumi, vitamine e integratori minerali

• L’ingegneria genetica è stata usata per aumentare la quantità e purezza di enzimi, per migliorare la funzione di un enzima e per fornire un metodo più conveniente per produrre enzimi.

 La Chimosina, usata per produrre formaggio, è una delle prime prodotte

1590 - Zacharias Janssen - Prime due lenti per microscopio (30) 1665 - Robert Hooke - “Cellulae” (Piccole Camere) del sughero

1676 - Anthony van Leeuwenhoek – (200) «animalculi» (in stagni) 1684 – «» protozoi e funghi

Basi della Moderna Biotecnologia.

• 1838, Matthias Schleiden, stabilì che tutti i tessuti delle piante sono composti da cellule e che ogni pianta deriva da una singola cellula

• 1839, Theodor Schwann arrivò a una conclusione simile per gli animali

• 1858, Rudolf Virchow, concluse che tutte le cellule derivano da cellule e la cellula è l’unità base della vita

• Prima della teoria cellulare si credeva nel vitalismo: l’organismo intero, non sue singole parti, possedevano la vita

• Dall’inizio degli anni 1880, i microscopi, le tecnologie di conservazione dei tessuti e le colorazioni permisero agli scienziati di capire meglio la struttura e le funzioni delle cellule

• 1928 - Fred Griffith effettuò esperimenti usando lo Streptococcus pneumonia Due ceppi: Liscio (S) - Virulento (gelatinoso) e Ruvido (R) - Meno Virulento Iniettando l’R e l’S (pastorizzato) – il gatto moriva e conteneva batteri S Non sicuro di cosa cambiava R in S, egli indicò ciò col termine “Principio di Trasformazione”.

Principio di Trasformazione.

Estratti Batterio

Liscio capsulato infettivo

Cellule infettate uccise dal calore;

fatto un estratto

Gli estratti trattati con batteri Infettivi, rugosi non capsulati

Trattato con

desossiribonucleasi (spezza il DNA)

Trattato con ribonucleasi (spezza l’RNA)

Trattato con proteinasi (spezza le proteine)

Nessuna cellula trasformata nella forma capsulata, infettiva

Alcune cellule trasformate nella forma capsulata, infettiva

Alcune cellule trasformate nella forma capsulata, infettiva

1952 – Alfred Hershey e Martha Chase.

• Usano il batteriofago T2, un virus che infetta i batteri

• Radio marcano il batteriofago con S35 (Proteina) e P32 (DNA)

• Infettano le cellule batteriche e centrifugano per rimuovere le particelle del fago

• L’analisi mostrò del DNA marcato all’interno dei batteri e che questo era materiale genetico.

infezione cellula batterica

marcatura interna alla cellula

la marcatura rimane se il virus

viene rimosso

particelle di virus con proteina marcata

particelle di virus con DNA marcato

1953 - Watson e Crick.

• Determinazione della struttura del DNA

• Rosalind Franklin e Maurice Wilkins forniscono i dati di diffrazione ai

raggi X

• Erwin Chargaff determina i rapporti delle basi azotate nel DNA

• 1953 - modello della replicazione del DNA

• Le basi del DNA sono fatte di purina e pirimidina

• A accoppia con T e G accoppia con C

• 1962 - Premio Nobel.

I Primi Esperimenti di DNA Ricombinante e la Tecnica Elettroforetica.

• Nel 1971 degli scienziati manipolano il DNA e lo inseriscono in batteri.

• Nel 1972 degli scienziati legano due molecole di DNA da diverse fonti usando l’endonucleasi EcoRI (per tagliare) e la DNA ligasi (per legare)

• H. Boyer successivamente nei Laboratori di Cold Spring Harbor scoprì una nuova tecnica detta gel elettroforesi per separare i

frammenti di DNA

 Si applica una corrente e le

molecole cariche negative del DNA migrano verso il polo positivo e si separano in funzione della loro dimensione

La Rivoluzione Biotech: Individuazione del Codice.

• Nel 1961, Nirenberg e Mattei fecero il primo tentativo di

individuare il codice genetico, usando l’RNA messaggero (m- RNA) sintetico.

• Nirenberg e Leder, usando le sequenze di codoni specifici del RNA, svilupparono un saggio di legame che consentì loro di

determinare quale tripletta di

codoni esprime un amminoacido.

Prima Base

Seconda Base Terza

Base

U C A G

U

fenilalanina serina tirosina cisteina U

fenilalanina serina tirosina cisteina C

leucina serina stop stop A

leucina serina stop triptofano G

C

leucina prolina istidina arginina U

leucina prolina istidina arginina C

leucina prolina istidina arginina A

leucina prolina istidina arginina G

A

isoleucina treonina asparagine serina U

isoleucina treonina asparagina serina C

isoleucina treonina asparagina arginina A (inizio)

metionina treonina asparagina arginina G

G

valina alanina aspartato glicina U

valina alanina aspartato glicina C

valina alanina aspartato glicina A

valina alanina aspartato glicina G

Il Codice Genetico Standard.

translation start codon hydrophobic amino acids negatively charged amino acids cysteine

C G

G C

UUU UUC UUA UUG

Phe Phe Leu Leu

F F LL

CUU CUC CUA CUG

Leu Leu Leu Leu

L L L L

CCU CCC CCA CCG

Pro Pro Pro Pro

P P

P P

UCU UCC UCA UCG

Ser Ser Ser Ser

S S SS

UAU UAC UAA UAG

Tyr Tyr Stop Stop

Y Y

CAU CAC CAA CAG

His His Gln Gln

H H

Q Q

ACU ACC ACA ACG

Thr Thr Thr Thr

H H

Q Q

AUUAUC AUA

Ile Ile Ile

I I

I

AUG Met M

GUU GUC GUA GUG

Val Val Val Val

V V

V V

GCU GCC GCA GCG

Ala Ala Ala Ala

A A

A A

GAU GAC GAA GAG

Asp Asp Glu Glu

D D

E E

GGU GGC GGA GGG

Gly Gly Gly Gly

G G

G G

AAU AAC AAA AAG

Asn Asn Lys Lys

N N

K K

AGU AGC AGA AGG

Ser Ser Arg Arg

S S

R R

G A C U G A C U G A C U G A C U

CGU CGC CGA CGG

Arg Arg Arg Arg

R R

R R

UGU UGC UAG

Cys Cys

Stop

C C

UGGUGA ^TrpStopW

U

U A

A

Il primo Clonaggio del DNA e ……

• Boyer, Helling Cohen, e Chang legarono dei frammenti di DNA in un vettore, e

trasformarono una cellula dell’E. coli

• Cohen e Chang trovarono che era possibile mettere del DNA batterico in una specie batterica non correlata

• Nel 1980 Boyer e Cohen ottennero un brevetto sui metodi fondamentali di clonaggio e trasformazione del DNA.

 La tecnologia del DNA ricombinante aprì dibattiti tra gli scienziati, teologi, media, avvocati e altri

 Negli anni 1980 si concluse che la tecnologia non ha causato alcun disastro e non porta minacce alla salute umana e all’ambiente.

 Nel 1997 si clona la pecora “Dolly” a Edimburgo.

Taglio con EcoRI

GAATTC CTTAAG

GAATTC CTTAAG

Taglio con EcoRI

AATTC G

G CTTAA

Congiunzione terminali del vettore e DNA estraneo

Chiusura della lacuna nel plasmide chimerico con DNA Ligasi

C G

DNA ligasi

C G

Sviluppo Industriale del Biotech.

Si costituiscono le prime compagnie biotech:

1976 - Genentech 1978 - Biogen 1980 - Amgen 1981 - Immunex 1981 - Chiron 1981 – Genzyme



I 160 farmaci e vaccini biotech approvati hanno aiutato più di 325 milioni di persone in tutto il mondo.



Attualmente sono in studi clinici più di 350 farmaci e vaccini biotech per combattere oltre 200 malattie.



La Biotecnologia è responsabile di centinaia di test diagnostici, inclusi i test su HIV e i test di gravidanza, mappatura del DNA …

I Progressi Continuano.

• Però, si sono addensate preoccupazioni sia sulle applicazioni che sulle implicazioni etiche :

 Esperimenti di terapia genica hanno sollevato la questione dell’eugenetica (selezione umana artificiale) come pure dell’analisi di malattie attualmente senza una cura

 Sono stati sviluppati cloni animali, e ciò ha accresciuto la paura che si possa passare alla clonazione umana

 In agricoltura, sussistono preoccupazioni sul contenimento genico e la creazione di “super infestanti” (piante resistenti a erbicidi e/o pesticidi)

 Oggi, le paure sono focalizzate sui cibi geneticamente ingegnerizzati in commercio e ha portato alla rapida crescita dell’industria dei cibi organici.

• Molte malattie geneticamente modificate, insetti, e piante resistenti agli erbicidi sono in attesa di approvazione alla commercializzazione

• Si sono identificati i geni coinvolti in alcune malattie

• Si sono sviluppati nuovi trattamenti medici

• Si è anche sviluppata la “fitomedicina” molecolare, in cui si usano piante per produrre farmaci (biofarmaci).

Dimensioni in Biotecnologia.

Nanometri _Micrometri Millimetri Metri

Piccole molecole Atomi

Aggregazioni Macro

molecole Cellule Organismi pluricellulari

Legame C-C Glucosio

Emoglobina

Ribosoma

Mitocondri

Batteri

Globuli rossi

C. elegans Uomo moderno

Bumblebee

10^-10m 10^-9m 10^-8m 10^-7m 10^-6m 10^-5m 10^-4m 10^-3m 10^-2m 10^-1m 10⁰m

1 nm 10 nm 100 nm 1 μm 10 μm 100 μm 1 mm 10 mm 100 mm 1 m

Virus.

• proteine implicate nella sintesi del DNA, RNA e di proteine

• regolazione genetica

• cancro e controllo della proliferazione cellulare

• trasporto di proteine e organelli all’interno delle cellule

• infezione e immunità

• possibili approcci alla terapia genica.

Batteri.

• proteine implicate nella sintesi di DNA, RNA e di proteine, metabolismo

• regolazione genetica

• bersagli per nuovi antibiotici

• ciclo cellulare

• comunicazione cellulare

Lieviti.

E.g. Saccharomyces cerevisiae

• controllo del ciclo cellulare e della divisione cellulare

• secrezione di proteine e biogenesi di membrane

• funzione del citoscheletro

• differenziazione cellulare

• invecchiamento

• regolazione genica e struttura dei cromosomi

Vermi.

E.g. Caenorhabditis elegans

• sviluppo del piano corpale

• linee cellulari

• formazione e funzione del sistema nervoso

• controllo della morte cellulare programmata

• proliferazione cellulare e geni del cancro

• invecchiamento

• comportamento

• regolazione genica e struttura dei cromosomi

Moscerino della Frutta.

Drosophila melanogaster

• sviluppo del corpo

• generazione di linee cellulari differenziate

• formazione del sistema nervoso, cuore e muscolatura

• morte cellulare programmata

• controllo genetico del comportamento

• geni del cancro e controllo della proliferazione cellulare

• controllo della polarizzazione cellulare

• effetti di farmaci, alcool e pesticidi.

Pesci – e.g. Zebrafish.

• sviluppo del tessuto corporeo vertebrato

• formazione e funzione del cervello e del sistema nervoso

• difetti di nascita

• cancro.

Topo.

• sviluppo dei tessuti corporei

• funzione del sistema

immunitario nei mammiferi

• formazione e funzione del

cervello e del sistema nervoso

• modelli di cancro ed altre malattie dell’uomo

• regolazione genica e ereditarietà

• malattie infettive.

Geni Omeotici.

• L’ordine dei geni omeotici è lo stesso;

• L’ordine dei geni corrisponde ad analoghe regioni del corpo.

Piante.

• Sviluppo e differenziazione dei tessuti

• genetica della biologia cellulare

• applicazioni in agricoltura

• fisiologia

• regolazione genica

• immunità

• malattie contagiose.

Specifiche del Genoma.

Hepatite B virus 1 4 3215

E. coli batterio 1 4,394 4,639,221

S. cerevisiae lievito 16 6,183 12,000,000

D. melanogaster moscerino 4 14,000 140,000,000

C. elegans nematodo 6 19,000 90,000,000

A. thaliana pianta 5 25,000 125,000,000

M. musculus topo 20 35,000 3,000,000,000

H. sapiens uomo 23 35,000 3,000,000,000

Organismo Tipo # Cromo- # Geni Dimensione Genoma somi (bp)

Specifiche del Genoma (2) .

Organismo Uomo Arabidopsis (pianta) C. elegans (verme)

Geni ~32,000 25,706 18,266

Organismo Drosophila (moscerino) Saccaromices (lievito)

Geni 13,338 ~6000

Metabolismo

Replicazione/modifica DNA Trascrizione/traslazione

Comunicazione intracellulare

Comunicazione intercellulare Organiz./degradazione proteine Trasporto

Proteine multifunzione

Citoscheletro/struttura Difesa e immunità Funzioni miste Sconosciuto

Una Tipica Modifica Genetica.

Batterio

Cromosoma batterico

Plasmide

DNA ricombinante (plasmide)

Batterio modificato

Il gene è inserito nel plasmide.

Il plasmide è acquisito da una cellula come un batterio.

Le cellule con il gene d'interesse sono clonate.

L'obiettivo è di fare O

copie del gene. L'obiettivo è di fare

prodotti proteici del gene.

Gene di interesse Si isola un vettore,

quale un plasmide.

Si rompe in frammenti il DNA con un enzima.

DNA contenente il gene di interesse.

Tipi di Sistemi d’Espressione.

 Batteri

 Insetti

 Lieviti

 Linee di cellule di mammiferi

 Transgenica

 Animale

 Pianta

Batteri.

Vantaggi

1. Genetica semplice e ben caratterizzata

2. Rapida crescita cellulare (raddoppia in 20-30 minuti)

3. Facili da crescere in mezzi di cultura non costosi

4. Fermentazione facile nell'ampliamento di scala

5. Alti livelli di espressione

Svantaggi

1. Mancanza di glicosilazione e altre modifiche post-

traslazionali

2. La rottura delle cellule provoca problemi più

complessi di purificazione

3. Formazione di corpi di inclusione; è necessario solubilizzare e ricostruire

4. Presenza di endotossine e proteine delle cellule ospiti

Lieviti (e.g. S. cerevisiae, P. pastoris).

Vantaggi

 Genetica ben conosciuta

 Rapida crescita cellulare (raddoppia in 90 min)

 Mezzi culturali poco costosi

 Fornisce e facilita la formazione di legami disolfuro

 Relativamente pochi problemi di purificazione

Svantaggi

 Le proteine possono essere glicosilate e organizzate in modo non corretto

 La over-glicosilazione è un rischio

 Altre modifiche post-

traslazionali sono limitate

 Generalmente livelli di

espressione inferiori a quelli dei sistemi batterici

Cellule di Insetti (Baculovirus vector).

Vantaggi

 Disponibili sistemi di secrezione

 Attivate le modifiche post- traslazionali richieste per le proteine eucariotiche superiori

 Alta espressione

 I vettori Baculovirus non sono patogeni per l’uomo

Svantaggi

 Lenta crescita cellulare

 Mezzi di cultura costosi

 Possibilità di modifiche post-traslazionali non identiche a quelle dei sistemi superiori

 Sensibile a forze di taglio

Cellule di Mammiferi.

Vantaggi

 Glicosilazione di tipo complesso

 Altre modifiche post- traslazionali

 Disponibili sistemi secretori

Svantaggi

 Lenta crescita cellulare (raddoppia in 18-24 ore)

 Bassa densità cellulare finale

 Mezzi di cultura costosi

 Sensibile a forze di taglio

Produzione di vaccini, enzimi, ormoni, MAbs, proteine native o modificate, proteine di fusione

CHO NSO

Cellule umane – preoccupazione: potenziali trasportatori di malattie

Differenti Tipi di Cellule.

Procariote



Nessun vero nucleo



Nessun organello legato alla membrana



Piccole dimensioni



Cromosoma circolare



Cellule singole

Eucariote



Nucleo con membrana



Organelli intracellulari



Può contenere

cromosomi multipli lineari



Generalmente cellule più grosse



Si possono organizzare in organismi

multicellulari

Cellule Procariote.

E. Coli

Ribosoma Proteine

mRNA tRNA DNA

Lipopolisaccaride

Fosfolipide Lipoproteina Peptidoglicano

Cellule Eucariote.

Membrana nucleare Nucleo

Nucleolo Cromatina

Centrioli Apparato di Golgi

Vacuolo Ribosomi

liberi

endoplasmatico Reticolo

Membrana cellulare Mitocondrio Lisosoma

endoplasmatico Reticolo ruvido

Reticolo liscio endoplasmatico

Metabolismo Cellulare.

Metabolismo Cellulare (Ciclo Acido Citrico, CTA).

È utile pensare all’ossidazione metabolica dei substrati come a un processo a 3 stadi:

 il carbonio è incorporato nell’acetil-CoA

 il carbonio viene quindi

ossidato a CO₂, agenti ridotti di trasferimento elettronico e una piccola quantità di ATP

 gli agenti ridotti di

trasferimento elettronico sono riossidati fornendo energia per la sintesi di ulteriore ATP

(fosforilazione ossidativa)

L’attività del ciclo TCA è favorita da bassi rapporti NADH/NAD⁺

Promesse del Biotech in Campo Medico.

DNA proteine

Alcuni farmaci sono così complessi che si possono sintetizzare solo in sistemi viventi.

Promesse del Biotech in Campo Vegetale.

• Riso “giallo”

• Rilevazione di Mine

Riso giallo con il riso bianco standard.

A livello mondiale, 7% dei bambini presentano deficienza da vitamina A; molti vivono in regioni in cui il riso è un alimento della dieta.

Mina

• Proteina transgenica

brevettata, inserita in piante

• In presenza di metalli provenienti dalla mina:

• La pianta vira dal verde al rosso

Prodotti della Microbiologia.

Cellule

Cellule lievito

Bio-conversione

Prodotto (per esempio,

Bioconversione steroidi) Cellule Substrato

Composti chimici (per es. acido citrico)

Prodotti da cellule

Enzimi (per esempio, glucosio isomerasi)

Antibiotici (per esempio, penicillina)

Alcol (etanolo) Additivi per

cibi (per esempio, amminoacidi)

Prodotti Industriali e i Microorganismi che li Producono.

• Le proprietà di un utile microbo industriale includono:

– Produce spore o si può facilmente inoculare

– Cresce rapidamente su ampia scala in mezzi a basso costo – Produce rapidamente il prodotto desiderato

– Non è patogeno

– E’ soggetto a manipolazione genetica

• I prodotti microbici di interesse industriale includono:

– Cellule microbiche – Enzimi

– Antibiotici, steroidi, alcaloidi – Additivi per cibi

– Composti chimici di base

• Composti a basso costo prodotti in bulk

• Includono etanolo, acido citrico, acid lattico e vari altri.

Produzione e Scala.

• Il Fermentatore è una apparecchiatura dove avviene il processo microbiologico

• Qualsiasi reazione su larga scala si indica come fermentazione

– Per lo più sono processi aerobici

• Dimensioni dei fermentatori: 5 - 500,000 litri

• Fermentatori aerobici / anaerobici

• I fermentatori su grande scala sono quasi sempre in acciaio

- Giranti e spruzzatori alimentano l'O₂

Produzione dell'Aceto.

1/2 O₂ H₂O

Citocromo o

Protone forza motrice

2 H ATP 2 H

UQ UQH₂ UQ UQH₂

CH₃CH₂OH Etanolo

CH₃CHO Acetaldeide

CH₃COOH Acido acetico

Alcol Aldeide

Produzione dell'Aceto (2).

Sfiato

Tubi di ricircolo Pompa

Grata di legno

Camera di raccolta

Materiale di partenza

Ingresso aria ossidazione Serpentine di Raffreddamento

Prelievo prodotto

Trucioli

di legno

Innovazione nei Sistemi di Produzione di Enzimi.

Piattaforme

SVILUPPO DI PROCESSO

Prodotto

Valutazione su 10 L

Ampliamento di scala

> 100.000L

Molecola di interesse

Aspergillus

Trichoderma

B. substilis

Streptomyces B. licheniformis

test iniziali:

Definite piattaforme per una rapida scelta di sistemi ospiti ottimali

Mezzi per analisi dei ceppi:

DNA arrays

Sequenza Genoma Secrezione

Stabilità prodotto

Miglioramento Ceppi:

siRNA HTS FACS

Modifiche genetiche

Antibiotici.

 Richiedono un preciso controllo dei nutrienti

 Si può modificare il prodotto finale per dare una varietà di derivati (per es.

penicilline

semisintetiche)

Lattosio

Penicillina

Cellule

Ammoniaca Carica

azoto Carica glucosio

Biomassa (g/L), carboidrato, Ammoniaca, penicillina (g/L×10)

Via Biosintetica della Penicillina.

Acido L-Amminoadipico L-Cisteina L-Valina

Acil-trasferasi

Cefalosporine

IPN sintasi

iso-penicillina N

ACV sintasi

ACV-Tripeptide

Produzione Industriale delle Penicilline.

Fermentazione della Penicillina

Aggiunta precursore I

Aggiunta precursore III

Trattamento chimico o enzimatico

della penicillina G

Aggiunta

catene laterali per via chimica Penicillina III

biosintetica Penicillina II

biosintetica Penicillina I biosintetica

Penicilline naturali (per esempio,

penicillina G)

Penicilline semisintetiche (per esempio, ampicillina, amoxicillina, meticillina) Acido 6-amminopenicillanico Aggiunta

precursore II

Meccanismi di Regolazione.

Regola l'attività enzimatica

No prodotto

Enzima B

Regola la sintesi dell'enzima Alla traslazione Alla trascrizione

no mRNA No enzima

Substrato Prodotto

Enzima A Traslazione

Trascrizione

Modificazione dell'Espressione Genica.

Consente la sovrapproduzione di un prodotto, produzione di più di un prodotto da parte dello stesso organismo, o la sintesi di prodotti

modificati.

 Architettura del percorso

 analisi, progettazione e modifica del percorso biochimico per migliorare l'efficienza del processo;

 Ingegnerizzazione del percorso metabolica

 Alterazione intenzionale del percorso metabolico per inattivazione di specifici geni;

 Ingegnerizzazione del controllo metabolico

 alterazione dei meccanismi di controllo di specifici geni.

Sistemi Esperti in Biotecnologia

Flusso

Controlli in linea

Biotecnologia:

Struttura Produttiva di un Impianto Pilota

Personale del bioprocesso Personale dei Servizi Centrali Materie prime

Intermedi e prodotti bulk Controllate, non classificate

Aree classificate (stanze sterili)

Corridoi di uscita (“sporchi”) Spazi per servizi (“grigi”)

Biotrasformazioni.

(trasformazione di un composto chimico in un altro mediante l'uso di un biocatalizzatore)

Scuola di Ingegneria Industriale e dell’Informazione

Corso 096125 (095857)

Introduction to Green and Sustainable Chemistry

Biotrasformazioni e Bioprocessi.

materie prime organiche

Bio-trasformazione

Preparazione Biocatalizzatore

Isolamento

Isolamento

prodotto Sottoprodotti

scarti

mutagenesi bioingegneria

“il processo con cui un materiale è convertito in un altro usando agenti biologici (cioè, organismi viventi, microbi o enzimi). Esso combina chimica, ingegneria, microbiologia e biochimica”.

Enzimi: Fonti e Usi.

A. I microrganismi si usano per produrre i catalizzatori naturali come gli enzimi B. Gli enzimi per uso industriale si purificano dai microorganismi

C. L'enzima seleziona uno specifico substrato al suo sito attivo

D. L'enzima catalizza la reazione chimica con cui si formano i prodotti E. Quindi si separano i prodotti dalla superficie dell'enzima

Efficacia Catalitica di Alcuni Enzimi.

Enzima Velocità di reazione non enzimatica (s^-1)

Velocità di reazione enzimatica (s^-1)

Aumento di velocità

Anidrasi Carbonica 1.3 × 10^-1 1 × 10⁶ 7.7 × 10⁶

Chorismato mutasi 2.6 × 10^-5 50 1.9 × 10⁶

Trioso fosfato isomerasi

4.3 × 10^-6 4300 1.0 × 10⁹

Carbossipeptidasi 3.0 × 10^-9 578 1.9 × 10¹¹

AMP nucleosidasi 1.0 × 10^-11 60 6.0 × 10¹²

Stafilococco nucleasi 1.7 × 10^-13 93 5.6 × 10¹⁴

Fonte: Radzicka, A.; Wolenden R. Science, 267, 91 (1995).

Purificazione e Funzioni degli Enzimi.

Purificazione:

•

Certamente una buona opzione per vari enzimi;

•

Processi costosi;

•

Ancora non pratici se sono richiesti dei cofattori (p.es.

reazioni redox).

Funzione:

•

Riconoscimento dei substrati;

•

Catalisi (abbassamento di E_att o S_att);

•

Selettività.

Specificità di substrato:

• Complementarietà geometrica;

• Complementarietà elettronica;

Stereo-specificità.

Da dove Ottenere gli Enzimi:

Cosa dire sull’uso di animali superiori?

• La società in generale è meno spaventata dalle forme macroscopiche della vita che dai membri del mondo microscopico

• L’uomo ha usato animali da molto tempo per biotrasformazioni

• Molte problematiche etiche e ambientali associate

• Spesso costoso.

… e sull’uso delle Piante?

• Grande diversità e capacità metabolica.

• Minori problemi etici e ambientali associati.

• Probabilmente non costosi

• Molti vecchi e nuovi lavori si riferiscono a cellule di piante in sospensione

• Del tutto simile all’uso di microorganismi ma in pratica più complicato

 Crescita lenta

 Frequente contaminazione

 Si richiedono attrezzature speciali

 Incredibilmente costoso.

Parti di Piante come Reagenti Chimici.

I problemi si possono superare se si usa la “pianta stessa”

(o una parte di essa) al posto di lavorare con una cultura cellulare:



Le cellule stanno già crescendo



Non sono richieste attrezzature speciali



Nessuna contaminazione



I cofattori sono già presenti



Pochi problemi ambientali



Costi molto contenuti.

Numero IUB e Classificazione degli Enzimi.

Principali Classi e Sottoclassi Principali Classi e Sottoclassi 1: Ossidoriduttasi

1.1: agisce sul gruppo CH-OH dei datori

1.2: agisce sul gruppo aldeide o cheto dei datori 1.3: agisce sul gruppo CH-CH dei datori

1.4: agisce sul gruppo CH-NH₂dei datori 1.5: agisce sul gruppo C-NH dei datori

1.6: agisce su NADH (ridotto) o NADPH come datore di H‾

1.7: agisce su altri composti azotati cone datore 1.8: agisce sul gruppi solforati come datore 1.9: agisce sul gruppo eme come datore

1.10: agisce su difenoli e sostanze correlate come datore

1.11: agisce su H₂O₂come accettore di elettroni 1.12: agisce su H₂come datore

1.13: agisce su singoli datori con incorporazione di ossigeno (ossigenasi)

1.14: agisce su datori abbinati con incorporazione di ossigeno in un datore (idrolasi).

2: Transferasi

2.1: trasferimento di gruppo a un-carbonio 2.2: trasferimento di aldeide o chetone 2.3: aciltrasferasi

2.4: glicosiltrasferasi

2.5: trasferimento di altri gruppi alchilici 2.6: trasferimento di gruppi azotati 2.7: trasferimento di gruppi fosforati 2.8: trasferimento di gruppi solforati

3: Idrolasi

3.1: idrolisi di legami esterei 3.2: idrolisi di legami glicosilici 3.3: idrolisi di legami eterei 3.4: idrolisi di legami peptidici

3.5: idrolisi di legami C-N diversi da peptidici 3.6: idrolisi di legame acido-anidride

3.7: idrolisi di legami C-C

3.8: idrolisi di legami C-alogenuro 3.9: idrolisi di legami P-N

4: Liasi

4.1: lisi di legami C-C 4.2: lisi di legami C-O 4.3: lisi di legami C-N 4.4: lisi di legami C-S

4.5: lisi di legami C-alogenuro 4.99: altri

5: Isomerasi

5.1: racemizzazione ed epimerizzazione 5.2: isomerizzazione cis-trans

5.3: ossidoriduzione intramolecolari, quali aldeide- chetone, cheto-enolo, migraz. di dopio legame 5.4: trasferimento intramolecolare di gruppo 5.99: altre isomerizzazioni

6: Ligasi

6.1: formazione di legami C-O 6.2: formazione di legami C-S 6.3: formazione di legami C-N 6.4: formazione di legami C-C

Classificazione degli Enzimi in Base al Tipo di Reazione.

CLASSI DI ENZIMI Tipo di REAZIONE CATALIZZATA ____________________________________________________

1. Ossidoriduttasi Reazioni di ossido-riduzione

2. Transferasi Trasferimento di gruppi funzionali

3. Idrolasi Reazioni idrolitiche (H₂O) o solvolitiche

4. Liasi Eliminazione di gruppi (per es. formazione di doppi legami)

5. Isomerasi Reazioni di isomerizzazione

6. Ligasi Formazione di legami accoppiata a idrolisi del trifosfato ATP

I Quattro Maggiori Tipi di Reazioni di Ossidazione Biologica Catalizzate da Ossidoriduttasi.

Deidrogenasi Rimuove due atomi di H dal substrato e trasferisce questo ad un altro

composto organico. L’accettore di H, A, è un coenzima.

SH₂+ A a S + AH₂

Ossidasi Rimuove due atomi di H dal substrato e utilizza O₂ o H₂O₂ come accettore di H.

SH₂+ ½O₂ a S + H₂O SH₂ + H₂O₂ a S + 2H₂O Tipo di

ossidazione

Descrizione Schema di Reazione ed Esempi

I Quattro Maggiori Tipi di Reazioni di Ossidazione Biologica Catalizzate da Ossidoriduttasi (2).

Diossigenasi Aggiunge due atomi di O al substrato S + O₂a SO₂ Monoossigenasi Aggiunge un atomo di O al substrato.

A è un coenzima.

S + AH₂ + O₂a SO + A + H₂O Tipo di

ossidazione

Descrizione Schema di Reazione ed Esempi

Reazioni di Eliminazione e Riarrangiamento Successive all’Ossidazione.

A. Demetilazione: Metil etere ad alcol

B. Demetilazione: Metil ammina ad ammina

C. Formazione dell’anello fenil metilendiossi

Reazioni di Eliminazione e Riarrangiamento Successive all’Ossidazione (2).

D. Apertura dell’anello aromatico (mono-ossigenasi)

E. Apertura dell’anello aromatico (di-ossigenasi)

F. Ossidazione dell’anello aromatico: NIH shift (shift d’idruro; R = gruppo alchilico)

Reazioni di Eliminazione e Riarrangiamento Successive all’Ossidazione (3).

G. Ossidazione in para dell’anello aromatico.

H. Decarbossilazione ossidativa di acidi carbossilici aromatici.

Formazione di Legami C-C per Spostamento S

_N

2 di un Nucleofilo Stabile su un Agente Elettrofilo Alchilante.

A. Metilazione di alcol o ammina con S-adenosil-L-metionina come agente alchilante:

B. Glicosilazione di un alcol con glicosil fosfato come agente alchilante: