Si utilizza lo strumento ImageQuantTM LAS 4010 (GE Healthcare) per acquisire
l’immagine di ogni gel sfruttando il fenomeno della fluorescenza. L’analisi viene effettuata con il software ImageQuantTM TL (GE Healthcare).
L’artrite reumatoide è una patologia immunitaria sistemica ad eziologia sconosciuta, caratterizzata da una persistente sinovite, generalmente simmetrica, delle articolazioni periferiche, la quale può degenerare assumendo carattere erosivo fino a distruggere le strutture articolari e periarticolari. Lo studio della proteomica salivare, applicato all’AR, è improntato all’individuazione di specifici marcatori proteici che possano essere identificativi dello stato di malattia o della risposta ad una terapia; può inoltre rappresentare un utile strumento di indagine per aiutare a comprendere i meccanismi biologici che stanno alla base di questa patologia e che sono ancora lungi dall’essere chiariti.
In uno studio precedente condotto da Giusti e al. è stato dimostrato che, attraverso l’analisi proteomica condotta sull’intera saliva di pazienti affetti da artrite reumatoide, in confronto a soggetti sani, è possibile individuare potenziali biomarcatori di patologia. L’elettroforesi bidimensionale seguita da spettrometria di massa ha permesso di identificare 8 proteine differenzialmente espresse nei pazienti con artrite reumatoide quando confrontati con controlli (soggetti sani). Tra queste, la GRP78/BiP, una molecola “chaperone” il cui compito è quello di guidare il corretto ripiegamento delle proteine cellulari, risultava essere 7 volte sovraespressa nei pazienti con AR. Dall’analisi della curva ROC è stato possibile definire la sensibilità e la specificità di questa proteina come indicatore della malattia. Oltre alla GRP78/BiP sono state individuate altre due proteine, 14-3-3σ e 14-3-3η, differenzialmente espresse nella patologia. Sono entrambe membri della famiglia di proteine 14-3-3 e coinvolte in numerose funzioni cruciali intracellulari come l’apoptosi, la trasduzione del segnale, il riavvolgimento ed il processamento delle proteine.[92]
GRP78/BiP è una proteina appartenente alla famiglia delle heat-shock protein70 (Hsp70) e localizzata nel reticolo endoplasmatico. Si tratta di una chaperonina ovvero una molecola coinvolta nel corretto folding dei polipeptidi in neo- formazione. Una sua up-regolazione si verifica in condizioni di ridotta concentrazione di glucosio o ipossia. Di conseguenza, una considerevole
sovraespressione di GRP78/BiP è stata osservata nel liquido sinoviale dei pazienti con artrite reumatoide tanto che essa può essere indicata come potenziale biomarker della malattia. Il suo ruolo nella regolazione dell’omeostasi del reticolo endoplasmatico è di fondamentale importanza ed è stato documentato il suo coinvolgimento in processi caratteristici dell’AR come la proliferazione dei sinoviciti e l’angiogenesi. GRP78/BiP ha un ruolo cruciale nella sopravvivenza dei sinoviciti ed una sovraespressione del gene Grp78, che codifica per la proteina, sembra prevenirne l’apoptosi. Inoltre promuove la chemiotassi e la proliferazione delle cellule endoteliali indicando una sua partecipazioni alla formazione dei nuovi vasi sanguigni a partire da quelli preesistenti.[93] Nello studio condotto da Giusti e al. è stato osservato per la prima volta un significativo incremento dell’espressione della proteina anche nella saliva dei pazienti affetti da artrite reumatoide, un risultato di particolare interesse che rimarca l’importanza di questo fluido biologico come strumento di indagine.[92]
La famiglia delle proteine 14-3-3 è un gruppo di proteine regolatorie con sequenza amminoacidica altamente conservata, coinvolte in molte funzioni cellulari quali i meccanismi di trasduzione del segnale, l’apoptosi, la regolazione del ciclo cellulare. Sono state identificate sette isoforme (β, γ, ε, ζ, η, σ, e θ) alcune delle quali riscontrate in elevate concentrazioni del liquido sinoviale di pazienti affetti da artrite reumatoide. In particolare, in uno studio del 2007 è stata per la prima volta determinata una forte correlazione tra i livelli delle isoforme γ e η presenti nel liquido sinoviale e l’aumentata espressione di metalloproteasi.[94] È ormai chiaro il ruolo di queste ultime nella progressione della patologia e sono da tempo identificate come biomarkers del danno articolare e coinvolte nel processo di distruzione di cartilagine e ossa. Studi precedenti hanno evidenziato livelli salivari della proteina 14-3-3σ raddoppiati rispetto al controllo sano.[34][31]
La Calgranulina B appartiene alla famiglia delle proteine S100 leganti il calcio ed ha un ruolo critico nel processo di infiammazione. Elevati livelli sono stati riscontrati sia nel liquido sinoviale che nella saliva dei pazienti con artrite reumatoide; inoltre la sua presenza nel siero risulta positivamente correlata con la proteina C-reattiva, la metalloproteasi MMP-3 e gli anticorpi anti peptidi citrullinati ciclici.
dell’articolazione.[95]
Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare in primo luogo se il trattamento con il farmaco Dekavil in un gruppo di pazienti affetti da AR fosse in grado di indurre variazioni nelle concentrazioni salivari di GRP78/BiP, 14-3-3σ e Calgranulina B, presi come potenziali indicatori dello stato di malattia, a 5 e a 9 settimane dal trattamento. Successivamente valutare se il trattamento inducesse un’alterazione nell’espressione basale del profilo proteico salivare dei pazienti con AR. Nello studio sono stati reclutati nove pazienti, provenienti dall’U.O di Reumatologia dell’Università di Pisa e dall’U.O.C. di Reumatologia dell’Università di Siena.
L’espressione delle proteine di interesse è stata valutata tramite analisi Western blot utilizzando anticorpi specifici. L’espressione di ogni proteina di interesse è stata quindi normalizzata sul totale delle proteine ed i risultati ottenuti sono riportati nei grafici sottostanti dove l’andamento di espressione è riferito ai tre tempi di trattamento (t0=basale; t1=dopo 5 settimane; t2=dopo 9 settimane) per i pazienti provenienti dalle due sperimentazioni. Di seguito sono riportate le immagini degli istogrammi ricavati dalle analisi dei risultati ottenuti con Western blot su campioni di saliva dei pazienti affetti da artrite reumatoide. Ogni istogramma è stato ottenuto dall’analisi dei campioni delle due coorti di pazienti (Figure 4.1, 4.2 e 4.3). In figura 4.4 sono riportati gli istogrammi relativi all’espressione della proteina GRP78/BiP nel siero di questi pazienti.
Figura 4.1 Istogramma relativo al Western blot utilizzato per la validazione della
proteina GRP78/BiP nella saliva e la valutazione della sua espressione ai tre tempi di trattamento. In ordinata è riportata la densità ottica normalizzata.
Figura 4.2 Istogramma relativo al Western blot utilizzato per la validazione della
proteina 14-3-3σ nella saliva e la valutazione della sua espressione ai tre tempi di trattamento. In ordinata è riportata la densità ottica normalizzata.
Figura 4.3 Istogramma relativo al Western blot utilizzato per la validazione della
proteina Calgranulina B nella saliva e la valutazione della sua espressione ai tre tempi di trattamento. In ordinata è riportata la densità ottica normalizzata.
Figura 4.4 Istogramma relativo al Western blot utilizzato per la validazione della
proteina GRP78/BiP nel siero e la valutazione della sua espressione ai tre tempi di trattamento. In ordinata è riportata la densità ottica normalizzata.
Al fine di valutare se vi erano variazioni del profilo proteico salivare indotte dal trattamento, l’approccio è stato quello di separare le proteine dei campioni di saliva per singolo paziente ai tre tempi (T0, T5 e T9),
bidimensionale. In Figura proteico salivare di un paziente
Figura 4.5 Immagine rappresentativa di un gel ottenuto mediante elettroforesi bidimensionale applicata ad un campione di saliva di un paziente affetto da artrite reumatoide. La separazione delle proteine è stata ottenuta mediante elettroforesi bidimensionale utilizzando una
12,5%. In evidenza tre spot trattamento.
Al fine di valutare se vi erano variazioni del profilo proteico salivare indotte dal ’approccio è stato quello di separare le proteine dei campioni di saliva per singolo paziente ai tre tempi (T0, T5 e T9), mediante
. In Figura 4.5 è riportata un’immagine rappresentativa del pattern proteico salivare di un paziente con artrite reumatoide.
Immagine rappresentativa di un gel ottenuto mediante elettroforesi a ad un campione di saliva di un paziente affetto da artrite reumatoide. La separazione delle proteine è stata ottenuta mediante elettroforesi bidimensionale utilizzando una IPG strip pH 3-10 e gel di SDS-poliacrilammide al 12,5%. In evidenza tre spots proteici diversamente espressi ai tre tempi di Al fine di valutare se vi erano variazioni del profilo proteico salivare indotte dal ’approccio è stato quello di separare le proteine dei campioni di saliva mediante elettroforesi immagine rappresentativa del pattern
Immagine rappresentativa di un gel ottenuto mediante elettroforesi a ad un campione di saliva di un paziente affetto da artrite reumatoide. La separazione delle proteine è stata ottenuta mediante elettroforesi poliacrilammide al teici diversamente espressi ai tre tempi di
di tempo di trattamento (T5 e T9). L’estrema variabilità tra i soggetti presi in esame ha portato ad una differenza di espressione significativa di soli tre spots (cerchiati in Fig. 4.5). In Figura 4.6 sono riportati gli istogrammi dei valori medi ± SD della densità ottica nelle tre condizioni per gli spots di interesse (spots n° 2667, 1600, 2020). Sia lo spot 2667 che lo spot 2020 risultano aumentare di intensità a seguito del trattamento con Dekavil mentre lo spot 1600 si riduce di intensità in modo significativo dopo 9 settimane dal trattamento. Dopo comparazione con le identificazioni ottenute dai numerosi studi condotti sulla saliva è stato possibile risalire all’identificazione dello spot 1600 con la proteina 14-3-3σ. In corso sono le identificazioni degli altri due spots che risultano aumentare in risposta al trattamento.
Figura 4.6 Immagine ingrandita d variazione di densità di ogni spot ai che riportano la percentuale d
(BSL=basale, W5=dopo 5 settimante dall’inizio del trattamento, W9=dopo 9 settimane dall’inizio del trattamento)
Immagine ingrandita dei tre spots proteici identificati. Viene illustrata la variazione di densità di ogni spot ai tre tempi di trattamento ed i relativi istogrammi che riportano la percentuale del volume di proteina espressa.
basale, W5=dopo 5 settimante dall’inizio del trattamento, W9=dopo 9 settimane dall’inizio del trattamento)
ei tre spots proteici identificati. Viene illustrata la i relativi istogrammi basale, W5=dopo 5 settimante dall’inizio del trattamento, W9=dopo 9
Oggetto del lavoro è stato quello di valutare la differenza di espressione delle proteine di maggior interesse in campioni di saliva di soggetti sottoposti a trattamento con il farmaco biologico Dekavil.
I risultati ottenuti sia dall’elettroforesi bidimensionale che dall’analisi Western blot documentano una riduzione dell’espressione delle proteine GRP78/BiP e 14-3-3σ a seguito del trattamento con Dekavil. Per quanto riguarda la GRP78/BiP, la riduzione si osserva dopo 5 settimane di trattamento mentre per la 14-3-3σ una riduzione si osserva dopo 9 settimane. Tuttavia il numero esiguo di pazienti arruolati, unitamente ad una probabile variabilità individuale nelle risposte, al momento non permette una significatività statistica del risultato, ad esclusione della proteina 14-3-3σ. Il dato della 14-3-3σ ritrova conferma nell’analisi bidimensionale dove questa proteina risulta seguire lo stesso andamento nei livelli di espressione salivare, con una risposta in riduzione significativa a 9 settimane. Tramite questa analisi sono stati individuati altri due spots la cui espressione risulta modulata dal trattamento con Dekavil in modo significativo.
Un’indagine sui livelli di GRP78/BiP è stata condotta anche sul siero e dai risultati ottenuti non si evince una variazione significativa nel corso della terapia indicando che le concentrazioni proteiche nella saliva non sempre sono un riflesso di quelle presenti nel siero.