Agar Spot Test e Agar Well Diffusion

La capacità di produrre batteriocine è stata valutata, tramite la tecnica dell’Agar Spot test e dell’Agar Well Diffusion, su tutti i ceppi di enterococchi isolati da carne cruda di manzo e avicoli in cui non è stata riscontrata la contemporaneamente contaminazione del genere Listeria. Il primo screening effettuato è stato l’agar spot test, che ha consentito di individuare i ceppi con attività antimicrobica nei confronti del microrganismo indicatore L. monocytogenes ATCC 7644 (figura 4.4). I ceppi positivi all’agar spot test sono stati poi sottoposti al metodo dell’agar well diffusion, al fine di individuare eventuali composti inibitori secreti nel mezzo liquido di crescita.

Fig. 4.4. Agar spot test con evidenti aloni di inibizione dei ceppi 374 e 2658 nei confronti di L. monocytogenes ATCC 7644.

L’agar spot test è stato eseguito su 71 ceppi di Enterococcus spp. isolati da carne bovina e su 66 ceppi isolati da carne avicola. Dall’analisi effettuata, la presenza di composti inibitori secreti dagli enterococchi isolati da manzo è risultata essere circa il doppio rispetto alla carne avicola, con rispettivamente 30 ceppi (42,3%) e 13 ceppi (19,7%) che hanno dato esito positivo al test (figura 4.5).

Fig. 4.5. Percentuale dei ceppi risultati positivi e negativi all’agar spot test. 19,7% 80,3%

avicoli

ceppi positivi all'agar spot test ceppi negativi all'agar spot test 42,3% 57,7%

manzo

ceppi positivi all'agar spot test ceppi negativi all'agar spot test

Dei 30 ceppi isolati da manzo risultati positivi al test, 13 appartengono alla specie E.

faecalis, 13 a E. faecium, 3 a E. durans e 1 a E. avium. Dei 13 ceppi isolati da avicoli

risultati positivi al test, 7 appartengono alla specie E. faecalis, 2 a E. faecium, 2 a E.

avium, 1 a E. durans e 1 a E. casseliflavus (figura 4.6).

Fig. 4.6. Distribuzione delle specie di Enterococcus positive all’agar spot test, per matrice alimentare.

I surnatanti dei ceppi che hanno dato esito positivo all’agar spot test sono stati testati con la tecnica dell’agar well diffusion (figura 4.7) e successivamente trattati con proteasi, per accertare l’effettiva natura proteica dell’agente inibente la crescita di

Listeria monocytogenes ATCC, e con catalasi, al fine di escludere l’attività inibitoria

prodotta dal perossido d’idrogeno sulla crescita di L. monocytogenes ATCC.

Fig. 4.7. Aloni di inibizione prodotti dai surnatanti dei ceppi di Enterococcus 945 e 1470 con la tecnica dell’agar well diffusion.

Dei 30 ceppi di Enterococcus spp. isolati da carne bovina e dei 13 ceppi di

Enterococcus spp. isolati da carne avicola, rispettivamente 9 e 3 hanno dato esito

positivo all’agar well diffusion. In seguito a trattamento con proteasi, è stato possibile escludere la natura proteica di uno dei 3 surnatanti provenienti dai ceppi isolati da carne avicola, deducendone quindi che l’attività inibitoria non era dovuta alla presenza di batteriocina (figura 4.8). 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% E. faecalis _E.faecium E. durans _E. avium E.  casseliflavus 43,3% _43,3% 10,1% 3,3% 53,8% 15,4% 7,7% 15,4% 7,7% %  campioni  positivi manzo avicoli

Come per l’agar spot test, anche in questo caso si può affermare che, tra i surnatanti degli enterococchi risultati positivi all’agar spot test, quelli isolati da manzo hanno dato esito positivo all’agar well diffusion per circa il doppio (30%) rispetto a quelli isolati da carne avicola (15,4%).

Fig. 4.8. In seguito a trattamento con proteasi, il surnatante del ceppo 4072 produce l’alone di inibizione.

Per quanto riguarda i surnatanti dei ceppi provenienti da manzo, sono risultati positivi 2 ceppi di E. faecalis, il 6,1% dei 33 enterococchi appartenenti a questa specie presi in esame, e 7 ceppi di E. faecium, il 25% dei 28 appartenenti al campione iniziale (figura 4.9). Degli enterococchi di origine bovina testati, quindi, la specie E. faecium è risultata maggiormente produttrice di batteriocine rispetto a E. faecalis.

Fig. 4.9. Risultati dell’agar spot test e dell’agar well diffusion sui surnatanti dei ceppi di Enterococcus spp. isolati in campioni di manzo.

Per quanto riguarda i surnatanti dei ceppi provenienti da avicoli, sono risultati positivi 1 ceppo di E. faecalis, il 3,5% dei 29 enterococchi appartenenti a questa specie presi in esame, e 1 ceppo di E. avium, il 33,3% dei 3 appartenenti al campione iniziale (figura 4.10). 0 5 10 15 20 25 30 35

E. faecalis E. faecium E. durans E. avium

enterococchi 33 28 9 1

agar spot test 13 13 3 1

agar well diffusion 2 7 0 0

Fig. 4.10. Risultati dell’agar spot test e dell’agar well diffusion sui surnatanti dei ceppi di Enterococcus spp. isolati in campioni di avicoli.

In conclusione, hanno dimostrato di essere produttori di batteriocina 9 ceppi di

Enterococcus spp. su 71 (12,7%) provenienti da carne di manzo, e 2 ceppi su 66 (3%)

provenienti da carne di avicoli. Per convenienza, i ceppi produttori sono stati indicati con le seguenti sigle:

 FMm1, FMm2, FMm3, FMm4, FMm5, FMm6 e FMm7 i ceppi di E. faecium e FLm1 e FLm2 i ceppi di E. faecalis provenienti da carne di manzo;

 FLa1 il ceppo di E. faecalis e Aa1 il ceppo di E. avium provenienti da carne avicola.

Da segnalare, infine, la presenza in 6 surnatanti testati (tabella 4.3) di due aloni di inibizione: un alone prossimale, caratterizzato da margini meno netti, in cui è completamente assente la crescita di L. monocytogenes ATCC, ed un alone distale, caratterizzato da margini decisi, in cui è visibile una riduzione della crescita del microrganismo indicatore. Tale fenomeno è stato riscontrato, oltre che nel test di agar well diffusion, anche in tutti i test supplementati eseguiti successivamente (valutazione dell’attività antimicrobica a differenti temperature, a differenti pH e nei confronti di differenti ceppi di Listeria monocytogenes) e può essere imputabile alla produzione di due batteriocine da parte del microrganismo testato, con una batteriocina più efficace rispetto all’altra e con effetti diversi sui vari ceppi di Listeria monocytogenes analizzati.

0 5 10 15 20 25 30

E. faecalis E. faecium E. durans E. avium E.  casseliflavus

enterococchi 29 28 5 3 1

agar spot test 7 2 1 2 1

agar well diffusion 1 0 0 1 0

Tab. 4.3. Valori dei diametri degli aloni di inibizione prossimale e distale ottenuti tramite la metodica dell’agar well diffusion.

Nel documento Batteriocine ad attività listericida prodotte da Enterococcus spp. (pagine 86-90)