Isolamento e identificazione dei ceppi provenienti da matrici alimentar

I ceppi di Enterococcus spp. e Listeria monocytogenes di origine alimentare utilizzati in questo studio sono stati isolati, nel periodo compreso tra gennaio 2002 e dicembre 2012, presso il laboratorio di Microbiologia Applicata del Dipartimento di Scienze della Salute dell’Università di Firenze. I campioni alimentari sono stati prelevati da personale esperto e trasportati all’interno di contenitori idonei e a una temperatura di circa 4°C in laboratorio, dove sono stati analizzati secondo metodiche standard e manipolati in condizioni di asetticità. Le colonie isolate e identificate sono state conservate a -80°C in terreno contenente triptone e glicerolo al 15%.

3.2.1 Isolamento e identificazione di Enterococcus spp.

Mediante l’uso di bilancia analitica di precisione, è stata prelevata un’aliquota di 25 g di alimento, inserita in un apposito sacchetto sterile con membrana a filtro Stofilter (pbi International) e diluita 1:10 tramite l’aggiunta di 225 ml di Acqua Peptonata Tamponata sterile (Buffered Peptone Water, Oxoid), un brodo di pre-arricchimento idoneo per rivitalizzare le cellule microbiche. La busta è stata inserita in omogeneizzatore

peristaltico a pale verticali per 60 secondi, al fine di omogeneizzare la sospensione e disperdere i batteri presenti nella matrice alimentare. Successivamente, 0,5 ml della diluizione 1:10 sono stati seminati per spatolamento sul terreno di coltura Slanetz and Bartley medium (Oxoid), un terreno idoneo per l’isolamento degli enterococchi, che risulta essere selettivo per la presenza di azide sodica, che inibisce lo sviluppo di microrganismi Gram-negativi e stafilococchi, e differenziale per la presenza di cloruro di tetrazolio, che, una volta ridotto dagli enterococchi a formazano, conferisce alle colonie una colorazione rosso-marrone (Slanetz and Bartley, 1957; Burkwall and Hartman, 1964). Le piastre sono state poste a incubare a 44°C per 48 ore in condizioni di aerobiosi. Al termine del periodo di incubazione, è stata verificata la presenza di microrganismi appartenenti al genere Enterococcus esaminando la morfologia delle colonie. Sono state considerate come tipiche le colonie aventi una colorazione dal rosa al rosso scuro e marrone.

Per confermare la presenza di Enterococcus spp., sono stati eseguiti dei test preliminari e di identificazione volti ad evidenziare caratteristiche metaboliche discriminanti.

Test della catalasi

L’enzima catalasi, di cui gli enterococchi non sono provvisti, appartiene alla famiglia delle ossido-riduttasi e catalizza la reazione di scissione del perossido di idrogeno in acqua e ossigeno molecolare, neutralizzandone l’azione ossidante:

2 H2O2 ↔ O2 + 2 H2O + energia.

La presenza dell’enzima è stata valutata ponendo una colonia batterica o un frammento di essa in contatto con una goccia di Perossido di Idrogeno al 3% (10 Volumi). La liberazione di ossigeno nascente segnala la presenza dell’enzima.

Valutazione della capacità emolitica

Le colonie risultate negative al test della catalasi, sono state seminate su piastre contenenti agar sangue di montone e incubate a 37°C per 24 ore, al fine di valutarne la capacità emolitica.

Test di identificazione biochimica

Sulle colonie con capacità di produrre α o γ emolisi, è stato effettuato il test di identificazione di specie RapID STR System (Oxoid), un sistema biochimico miniaturizzato per l’identificazione degli streptococchi dei gruppi A, B, C, D e G.

3.2.2 Isolamento e identificazione di Listeria monocytogenes

Mediante l’uso di bilancia analitica di precisione, è stata prelevata un’aliquota di 10 g di alimento, inserita in un apposito sacchetto sterile con membrana a filtro Stofilter e diluita 1:10 tramite l’aggiunta di 90 ml di Half Fraser Broth (Oxoid), un brodo di arricchimento primario per Listeria spp. Il sacchetto, dopo essere stato posto all’interno dell’omogeneizzatore a pale, è stato posto ad incubare a 28°C per 24 ore. Dall’arricchimento primario sono stati prelevati 100 µl di sospensione e inseriti in una provetta contenente 10 ml di Fraser Broth (Oxoid), un brodo di arricchimento secondario, che è stata posta a incubare a 37°C per 24 ore.

I terreni Half Fraser e Fraser Broth sono raccomandati dalla norma UNI EN ISO 11290 relativa alla ricerca di Listeria monocytogenes nei prodotti alimentari. Entrambi contengono citrato ferrico di ammonio, che grazie agli ioni ferrici favorisce la crescita di L. monocytogenes, esculina, che viene idrolizzata a esculetina da Listeria spp. con conseguente legame agli ioni ferrici e annerimento del brodo, e litio cloruro, che inibisce la crescita degli enterococchi che, come Listeria, idrolizzano l’esculina. Le due formulazioni differiscono per il fatto che il brodo Half Fraser contiene una quantità dimezzata di acido nalidixico e acriflavina, al fine di facilitare la rivitalizzazione delle cellule danneggiate (Fraser and Sperber, 1988; McClain and Lee, 1988; Cowart and Foster, 1985).

Al termine del periodo d’incubazione, 10 µl di sospensione batterica di arricchimento secondario sono stati seminati su terreno selettivo differenziale Listeria Palcam Agar (Oxoid). Questo terreno deve la sua alta selettività alla presenza di litio cloruro nel terreno di base e di ceftazidime, polimixina B e acriflavina cloridrato nel supplemento selettivo (Palcam Selective Supplement, Oxoid). Palcam Agar permette una più facile differenziazione di Listeria monocytogenes poiché utilizza un doppio sistema indicatore: l’idrolisi dell’esculina e la fermentazione del mannitolo. Listeria

monocytogenes idrolizza l’esculina e produce colonie circondate da un alone nero, ma

non fermenta il mannitolo, permettendo così una facile differenziazione da contaminanti come enterococchi e stafilococchi, che invece fermentano il mannitolo e causano il viraggio dal rosso al giallo dell’indicatore di pH rosso fenolo (Van Netten et al., 1989). La piastra seminata è stata incubata per 48 ore a 37°C in condizioni di microaerofilia per inibire la crescita dei batteri strettamente aerobi, come Bacillus spp. e Pseudomonas spp. Al termine del periodo di incubazione, l’aspetto tipico delle colonie di Listeria

monocytogenes è il seguente: colonie di circa 2 mm di diametro, di colore grigio

verdastro con centro nero, infossate e circondate da un alone nero.

Le colonie cresciute su Listeria Palcam Agar sono state sottoposte a test preliminari e di identificazione volti ad evidenziare caratteristiche metaboliche discriminanti.

Test della catalasi

L. monocytogenes possiede l’enzima catalasi. Il test è stato svolto con le stesse modalità

descritte nel paragrafo 3.2.1.

Valutazione della capacità emolitica

Listeria monocytogenes è in grado di produrre la listeriolisina O, una esotossina

batterica capace di creare pori nelle membrane e responsabile della lisi dei globuli rossi. Tale proprietà può essere individuata tramite la semina su Agar Sangue di cavallo (Oxoid), terreno di coltura contenente il 5% di sangue sterile defibrinato. Il batterio dà una caratteristica β-emolisi stretta e piccola.

Test di identificazione biochimica

Sulle colonie β-emolitiche è stata eseguita l’identificazione della specie utilizzando il test biochimico miniaturizzato Microbact 12L.