Influenza del mezzo di crescita sulla produzione di batteriocine

Un totale di 62 ceppi di enterococchi isolati da carne cruda di manzo, precisamente i 41 risultati negativi in prima analisi all’agar spot test, e i 21 risultati prima positivi all’agar spot test e poi negativi all’agar well diffusion (paragrafo 4.2), sono stati sottoposti a due diversi tipi di stimolazione al fine di valutare l’influenza del mezzo di crescita sulla produzione delle batteriocine.

Dei 62 ceppi di enterococchi presi in esame, la specie più numerosa è risultata essere E.

faecalis (50%), seguita da E. faecium (33,9%), E. durans (14,5%) e E. avium (1,6%)

(figura 4.19).

Fig. 4.19. Distribuzione di specie dei ceppi di Enterococcus spp. risultati negativi all’agar spot test e all’agar well diffusion.

Sono stati allestiti due esperimenti, condotti in parallelo: in uno, il ceppo di

Enterococcus da testare è stato fatto crescere in presenza di Listeria monocytogenes e,

nell’altro, in presenza del suo stesso surnatante.

Al termine dei periodi di incubazione (24, 48 e 96 ore), è stata valutata la presenza di attività inibitoria nei confronti di L. monocytogenes ATCC tramite il test dell’agar well diffusion: dei 62 ceppi di Enterococcus spp. testati, 2 (3,2%) hanno prodotto batteriocina in seguito all’esposizione a entrambi i due tipi di stimolazione. Un ceppo ha dato esito positivo esclusivamente al test di stimolazione eseguito con il suo surnatante, ma in seguito a trattamento con proteasi è stata esclusa la natura proteica della sostanza ad attività inibitoria, e pertanto anche la presenza di batteriocina.

0 5 10 15 20 25 30 35

E. faecalis E.faecium E. durans E. avium 31 21 9 1 n.  campioni  positivi

I 2 ceppi risultati positivi al test appartengono alla specie E. faecalis, e sono stati indicati per convenienza con le sigle FLm3 e FLm4. Entrambi hanno prodotto aloni di inibizione dal diametro di 15 mm, sia quando stimolati con Listeria monocytogenes, che quando stimolati con il loro stesso surnatante (figure 4.20 e 4.21).

Fig. 4.20. Agar well diffusion dei surnatanti di 4 diversi ceppi di Enterococcus stimolati dalla presenza di Listeria monocytogenes (a) e del loro stesso surnatante (b). Solo il ceppo 2809 (FLm3) mostra l’alone di inibizione. Il controllo positivo è costituito da surnatante contenente batteriocine.

Fig. 4.21. Agar well diffusion dei surnatanti di 4 diversi ceppi di Enterococcus stimolati dalla presenza di Listeria monocytogenes (a) e del loro stesso surnatante (b). Solo il ceppo 3246 (FLm4) mostra l’alone di inibizione. Il controllo positivo è costituito da surnatante contenente batteriocine.

Al fine di ottenere informazioni dettagliate relative alla curva di crescita dei ceppi testati, e per avere un’ulteriore conferma dell’azione battericida dei surnatanti contenenti batteriocina, ai tempi 24, 48 e 96 ore, la sospensione batterica contenente

Listeria monocytogenes ed Enterococcus è stata seminata sui terreni agarizzati Palcam,

Slanetz e TSA, mentre la sospensione batterica contenente Enterococcus e il suo surnatante, sul terreno TSA.

a

b 

Nelle figure 4.22 e 4.23 sono riportate le medie dei valori di densità cellulare (UFC/ml) ottenute per i ceppi di enterococchi risultati non produttori di batteriocina, rispettivamente quando stimolati con Listeria monocytogenes e con il loro surnatante. In entrambi gli esperimenti, gli enterococchi presi in esame hanno mostrato una crescita esponenziale nelle prime 24 ore, seguita da una fase stazionaria caratterizzata da una densità cellulare di circa 109 UFC/ml. La moltiplicazione di Listeria monocytogenes non è stata inibita dalla presenza degli enterococchi, e entrambe le specie batteriche hanno mostrato un tempo di generazione di circa un’ora e mezza.

Fig. 4.22. Andamento di crescita microbica di Enterococcus spp. non produttori di batteriocina in presenza di Listeria monocytogenes ATCC 7644, a diversi intervalli di tempo.

Fig. 4.23. Andamento di crescita microbica di Enterococcus spp. non produttori di batteriocina in presenza del loro stesso surnatante, a diversi intervalli di tempo.

t0 24h 48h 96h

Enterococcus spp. 2,3E+03 1,8E+09 1,5E+09 1,7E+09

Listeria monocytogenes 5,7E+02 5,0E+07 2,8E+08 5,8E+08

carico  microbico  (log 10 UFC/ml) t0 24h 48h 96h

Enterococcus spp. 2,4E+03 1,6E+09 1,7E+09 1,6E+09

carico

 microbico

 (log

10

Nell’esperimento di stimolazione con L. monocytogenes ATCC, i ceppi FLm3 e FLm4 hanno generato una curva di crescita simile a quella riscontrata per gli enterococchi risultati negativi al test: la densità cellulare dei due ceppi cresce in maniera esponenziale e dopo 24 ore di incubazione si stabilizza su valori di circa 109 UFC/ml. L.

monocytogenes ATCC, invece, mostra un rapido declino nelle prime 24 ore di

incubazione, seguito da una completa inibizione nei tempi successivi, a confermare la produzione, nel mezzo di crescita, di una sostanza ad attività antibatterica da parte del ceppo di enterococco stimolato (figura 4.24).

Fig. 4.24. Inibizione della crescita di Listeria monocytogenes ATCC causata dalle batteriocine prodotte dai ceppi FLm3 e FLm4 in seguito a stimolazione con L. monocytogenes ATCC.

Sui surnatanti prodotti dai ceppi FLm3 e FLm4 in seguito a stimolazione, sono stati effettuati i test supplementati di valutazione dell’attività antimicrobica a differenti temperature, a differenti pH e nei confronti di differenti ceppi di L. monocytogenes. Dai risultati ottenuti (figura 4.25) è possibile dedurre la termostabilità delle batteriocine testate: tutti i surnatanti subiscono una riduzione del diametro di inibizione all’aumentare dei tempi e della temperatura di esposizione, ma per entrambi i ceppi l’attività antimicrobica è mantenuta anche alla temperatura di 121°C×15 minuti. Sia per FLm3 che per FLm4, l’andamento dei diametri di inibizione è identico quando stimolati con L. monocytogenes e con il loro surnatante e in entrambi i casi, in seguito a esposizione alla temperatura di sterilizzazione, il diametro si riduce di 6 mm rispetto all’alone osservato nel controllo.

t0 24h 48h 96h carico  microbico  (log  10 UFC/ml) FLm3 Listeria monocytogenes ATCC+FLm3 FLm4 Listeria monocytogenes ATCC+FLm4

Fig. 4.25. Decremento, in seguito ai trattamenti termici, degli aloni d’inibizione prodotti dai surnatanti dei ceppi FLm3 e FLm4 ottenuti in seguito a stimolazione con L. monocytogenes ATCC e con il proprio surnatante.

Le enterocine prodotte da FLm3 e FLm4 si sono dimostrate stabili a valori di pH compresi tra 4 e 7, infatti in entrambi i ceppi non si sono verificate rilevanti modifiche nel diametro degli aloni d’inibizione per tutti i valori di pH testati (figura 4.26). In particolare, FLm4 ha prodotto dei diametri costanti per tutti i trattamenti, sia nel caso di stimolazione con L. monocytogenes che con il suo surnatante, mentre FLm3 ha mostrato valori più alti di attività, in entrambe le stimolazioni, per pH pari a 7.

Fig. 4.26.Variazione dell’attività listericida dei surnatanti testati ai valori di pH 4, 5, 6, 6.5 e 7.

Infine, nei confronti dei 28 ceppi di L. monocytogenes di provenienza alimentare e clinica, i surnatanti di FLm3 e FLm4 non hanno mai mostrato una completa inibizione, ma solo, in alcuni casi, una riduzione della crescita del microrganismo indicatore

5 7 9 11 13 15 diametro  mm FLm3+L. monocytogenes FLm3+surnatante FLm4+L. monocytogenes FLm4+surnatante 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Ph 4 Ph 5 Ph 6 Ph 6,5 Ph 7 diametro  mm FLm3+L. monocytogenes FLm3+surnatante FLm4+L. monocytogenes FLm4+surnatante

(tabella 4.7). In particolare, tra le listerie di origine alimentare, solo una isolata da carne avicola ha subito una riduzione della crescita a causa della presenza dei surnatanti di FLm3 e FLm4, mentre, tra le listerie di origine umana, la parziale inibizione è stata visibile nei confronti di un numero maggiore di ceppi. Questo atteggiamento può essere imputabile al fatto che, probabilmente, le batteriocine prodotte in seguito a stimolazione presentano una specificità di azione nei confronti di determinati antigeni presenti nel mezzo di crescita in cui sono state prodotte e, viceversa, perdono la loro capacità inibitoria nei confronti di ceppi batterici con i quali non hanno condiviso lo stesso habitat, che quindi non hanno stimolato la produzione delle batteriocine stesse.

      Surnatanti