Allestimento dei processi di micorisanamento:

3.2.1. Microrganismi impiegati nelle diverse prove di micorisanamento:

I ceppi fungini Allescheriella sp. DABAC 1 e Phlebia sp. DABAC 9 usati nella prima prova di micorisanamento del suolo modello erano stati precedentemente isolati, nel nostro laboratorio, dal sito ACNA (D’Annibale et al., 2006).

Irpex lacteus 617/93 e Pleurotus ostreatus 3004, sono stati ottenuti dalla collezione

di Basidiomiceti dell’istituto di Microbiologia dell’Accademia delle Scienze della Republica Ceca, (CCBAS) (Praga, Republica Ceca).

Pleurotus pulmonarius CBS 664.97 e Panus tigrinus CBS 577.79 sono stati

rhodina DABAC P82 proveniva dalla collezione di microrganismi del Dipartimento di

Agrobiologia ed Agrochimica dell’Università della Tuscia (Viterbo, Italia).

I ceppi utilizzati sono stati mantenuti a 4°C, in slant contenenti Potato Dextrose Agar (PDA, Oxoid), e periodicamente rinnovati.

3.2.2. Preparazione dell’inoculo:

La biomassa miceliare, necessaria a fornire l’inoculo per le prove di biorisanamento, veniva prodotta in coltura agitata, sospendendo in terreno liquido la biomassa fungina ottenuta dagli slant incubati a 28°C per 7-10 giorni.

Il micelio veniva omogeneizzato in sospensione acquosa con miscelatore Ultra- Turrax (Ika-Werk, Germania); la pre-coltura veniva condotta in terreno liquido contenete glucosio (10g/l) ed estratto di lievito (YE 5g/l), in beute Erlenmeyer da 500ml (contenenti 95ml di terreno e 5ml di sospensione miceliare), incubate a 28 °C in agitatore orbitale (B:Braun, Biotech. International, Germania), a 180 rpm, per 96h.

Le pellets ottenute venivano sottoposte a lavaggi con acqua deionizzata sterile e nuovamente frammentate con Ultra-Turrax in condizioni di asepsi, per moltiplicarne i centri di crescita e per omogeneizzare la sospensione poi utilizzata come inoculo nei processi di micorisanamento.

3.2.3. Micorisanamento del suolo modello:

Il suolo modello, contaminato in laboratorio secondo la procedura sopra descritta, è stato sottoposto a due diverse prove di micorisanamento nelle quali sono state utilizzate due diverse combinazioni di agenti mobilizzanti e ceppi fungini.

Nella prima prova, sono stati utilizzati i funghi white-rot Allescheriella sp. DABAC1 e Phlebia sp. DABAC9 in concomitanza con i seguenti agenti mobilizzanti: Tween20, Tween80 e olio di soia.

La seconda prova è stata condotta utilizzando i due ceppi fungini Irpex lacteus 617/93 e Pleurotus ostreatus 3004 e Tween20, Tween80, olio di soia, RAMEB ed acque di vegetazione delle olive, come agenti mobilizzanti.

Entrambe le prove di micorisanamento sono state allestite come segue: 5 ml delle pre-colture fungine (concentrazione di biomassa di circa 10 g/l) venivano impiegati come inoculo per stocchi di mais sterili (5 g), utilizzati come ammendanti per lo

In base all’umidità residua degli stocchi di mais e al volume di inoculo, è stata quindi calcolata l’umidità totale ed è stata aggiunta acqua sterile così da ottenere un’umidità ad inizio prova del 75% (p/p). I funghi sono stati fatti sviluppare su tale matrice incubando le beute a 28° C per 15 giorni e quindi venivano aggiunti 20 g di suolo precedentemente trattato con i surfactanti. Le beute, dopo aggiunta del suolo, sono state incubate nuovamente per 6 settimane a 28°C.

Ogni prova è stata condotta in triplicato e, per ognuna delle tesi sperimentali, sono state allestite in parallelo delle beute di controllo utilizzando il suolo trattato e non con gli agenti mobilizzanti, ammendate con gli stocchi di mais ma non inoculate con i funghi (Controllo di incubazione).

3.2.4. Micorisanamento del suolo storicamente contaminato da idrocarburi aromatici (Prova condotta con P. pulmonarius e B. rhodina):

Metà del suolo utilizzato in questo esperimento è stato sottoposto a fumigazione utilizzando cloroformio secondo la procedura descritta da Trevors (1996) mentre la restante metà è stata trattata seguendo lo stesso procedimento, ma in assenza di cloroformio (suolo non fumigato).

Successivamente, 32 g di suolo, sottoposto ai due diversi trattamenti, sono stati miscelati con 8 g di paglia di mais sterile, posti in beute Erlenmeyer da 500 ml e quindi inoculati con 20 ml di sospensione miceliare, come sopra descritto.

L’umidità finale è stata aggiustata fino ad ottenere un valore iniziale di circa il 37%; le beute sono state incubate per 45 giorni insufflando al loro interno aria umida non sterile (3- 5ml/min) per tutta la durata del processo.

Ogni prova è stata condotta in duplicato e, per ogni tesi sperimentale,sono state allestite in parallelo beute di controllo utilizzando suolo sottoposto o meno a fumigazione, ammendato con stocchi di mais, ma non inoculato con i funghi (Controllo di incubazione).

3.2.5. Micorisanamento del suolo storicamente contaminato da idrocarburi aromatici (Prova condotta con P. tigrinus):

Beute Erlenmeyer da 500 ml venivano riempite con 32 g di suolo, ammendato con 8 g [20% (p/p)] di stocchi di mais preventivamente sterilizzati (121°C - 20 min), ed inoculate con 20 ml di sospensione miceliare, preparata come sopra.

L’umidità finale è stata aggiustata fino ad ottenere un valore di circa il 37% ed è stata mantenuta per tutta la durata della prova aggiungendo acqua sterile in quantità tale da compensare quella eventualmente persa in seguito ad evaporazione.

Ogni prova è stata condotta in duplicato allestendo, oltre alle prove di biotrattamento, altre due tesi sperimentali di controllo (Tabella 3.4):

 Microcosmo: beute contenenti 40 g di suolo come tale;

 Controllo di incubazione: beute contenenti 32 g di suolo ammendato con 8 g di stocchi di mais sterili.

La prova è stata seguita nel tempo effettuando prelievi dei campioni diversamente trattati all’inizio (t0) e dopo 7, 15, 30 e 60 giorni di incubazione(t7, t15, t30, t60). I

campioni ad ogni prelievo venivano omogeneizzati, aliquotati in falcon sterili, congelati in azoto liquido e quindi mantenuti a -80°C sino al momento delle successive analisi.

Tabella 3.4: Schema riassuntivo delle tesi sperimentali allestite nella prova di biotrattamento

Nome del campione Tipo di campione

Microcosmo 40 g di suolo come tale

Controllo di incubazione 32 g di suolo come tale + 8 g di stocchi di mais

sterili

Suolo biotrattato con P. tigrinus 32 g di suolo come tale + 8 g di stocchi di mais

3.2.6. Micorisanamento del suolo storicamente contaminato da bifenili policlorurati:

La prova è stata effettuata in parallelo utilizzando sia suolo tal quale che sottoposto a pretrattamento con olio di soia (OS), aggiunto con dispersore spray sotto forma di emulsione (5%, p/p) acqua:olio (1:1); il suolo è stato mantenuto a 4°C al buio, per 6 giorni prima del suo utilizzo.

Il processo di micorisanamento è stato condotto in beute Erlenmeyer da 500 ml ed allestito come segue: 7,5 ml di sospensione miceliare, preparata come sopra, venivano utilizzati come inoculo per stocchi di mais sterili (7,5 g) sui quali, dopo aver fatto crescere il fungo per 15 giorni, venivano aggiunti come upper layer 30 g di suolo precedentemente trattato o meno con il surfactante.

In base all’umidità residua degli stocchi e al volume di inoculo, è stata quindi calcolata l’umidità totale ed è stata aggiunta acqua sterile così da ottenere un’umidità ad inizio prova del 10-15% (p/p).

Ogni prova è stata condotta in duplicato allestendo in parallelo ai processi di micorisanamento, altre due tesi sperimentali di controllo utilizzando sia suolo tal quale che pretrattato con olio di soia. Sono state, quindi, predisposte le seguenti tesi sperimentali:

 Microcosmo: 30g di suolo come tale;

 Microcosmo OS: 30g di suolo pretrattato con OS

 Controllo di incubazione (Cont. Incub.): 30g suolo aggiunti come upper layer su 7,5g di stocchi di mais sterili non inoculati con il fungo;

 Controllo di incubazione OS (Cont. Incub. OS): 30g suolo, pretrattato con OS, aggiunti come upper layer su 7,5g di stocchi di mais sterili non inoculati con il fungo;

 Biotrattato con P. tigrinus: 30g suolo aggiunti come upper layer su 7,5g di stocchi di mais precedentemente colonizzati dal fungo;

 Biotrattato con P. tigrinus OS: 30g suolo, pretrattato con OS, aggiunti come upper

layer su 7,5g di stocchi di mais precedentemente colonizzati dal fungo;

La prova è stata seguita nel tempo effettuando prelievi dai campioni diversamente trattati all’inizio (t0) e dopo 30 e 60 giorni di incubazione (t30, t60).

Le beute prelevate sono state preventivamente poste in camera fredda per 3-4 ore al fine di favorire la condensazione dei vapori in cui potevano essere presenti PCB. I campioni sono stati quindi omogeneizzati, aliquotati in falcon sterili, congelati in azoto liquido e mantenuti a -80°C fino alle successive analisi.