Biotrattamento di un suolo storicamente contaminato con Botryosphaeria

rhodina DABAC P82 e Pleurotus pulmonarius CBS 664.97:

P. pulmonarius CBS 664.97 e B. rhodinaDABAC P82 sono stati testati per le loro capacità di crescere e di degradare idrocarburi aromatici in suolo storicamente contaminato. Al fine di valutare quale fosse l’effetto della microflora endogena sull’intero processo, il suolo è stato sottoposto a fumigazione con cloroformio e le prove condotte sia sul suolo fumigato che non fumigato.

Per determinare quale fosse l’effetto del micorisanamento sulle comunità batteriche autoctone sono state effettuate sia conte vitali dei batteri eterotrofi che analisi DGGE del gene codificante l’rRNA 16S, direttamente sul DNA metagenomico estratto dai diversi campioni. Il numero dei batteri eterotrofi totali risultava superiore nei suoli non fumigati rispetto ai fumigati, soprattutto in quelli sottoposti a biotrattamento fungino: l’analisi DGGE è stata effettuata solo sui suoli non fumigati.

4.2.1. Crescita fungina:

Come era evidente dall’ispezione visiva, dopo 45 giorni di incubazione entrambi i funghi avevano colonizzato il suolo, fumigato e non, ammendato con paglia di mais. Per valutare l’entità della crescita di entrambi i ceppi fungini sia nel controllo di incubazione che nel suolo fumigato e non fumigato è stato estratto e quantificato l’ergosterolo: tale composto è ritenuto ottimo indicatore dello sviluppo fungino (Davis & Lamar, 1992).

Inaspettatamente, la crescita di B. rhodinaera minore nel suolo fumigato rispetto al non fumigato in contrasto a quello che invece si riscontrava nel caso di P. pulmonarius. Non era invece rilevabile ergosterolo nei controlli di incubazione, siano essi fumigati che non fumigati.

Le indicazioni ottenute dalla determinazione dell’ergosterolo venivano confermate anche dalla quantificazione delle proteine solubili i cui livelli risultavano maggiori nel suolo non fumigato e biotrattato con B. rhodina e nel suolo fumigato e biotrattato con P.

Tabella 4.4. Ergosterolo, proteine solubili e pH finale nei controlli di incubazione e nei suoli biotrattati con P. pulmonarius e B. rhodina fumigati e non fumigati.

I dati rappresentano la media±deviazione standard di quattro determinazioni (due repliche per due esperimenti indipendenti). L’analisi statistica veniva effettuata mediante test di Tukey: lettere uguali in apice indicano assenza di differenze statisticamente significative (P<0,05).

4.2.2. Degradazione dei contaminanti e detossificazione del suolo:

A differenza di una diversa risposta di crescita dei due funghi in seguito alla fumigazione, l’efficienza del processo di micorisanamento, sia sulla degradazione dei contaminanti che sulla detossificazione del suolo, era comunque maggiore in presenza della microflora indigena. La maggior parte dei contaminanti veniva, infatti, degradata nei suoli non fumigati e biotrattati con entrambi i funghi e questo effetto era particolarmente marcato nel caso di molti dei contaminanti presenti in quantità maggiori come ad esempio il 9,10-antracenedione e il 7-[H]-benzo[DE]-antracene-7-one (Tabella 4.5). A conferma di ciò, anche il valore di TWOC (Total Weight Organic

Contaminants) era decisamente minore nei suoli non fumigati e biotrattati con P. pulmonarius (1082 del non fumigato contro 1274 mg/kg di suolo del fumigato) e B. rhodina (939 del non fumigato contro 1235 mg/kg di suolo del fumigato) rispetto ai

suoli fumigati (Figura 4.11).

Il test ecotossicologico che è stato condotto era basato sulla mortalità degli insetti apterigoti ubiquitari del suolo, i Collemboli, appartenenti alla specie Folsomia candita. Nel caso della fumigazione i livelli di tossicità risultavano significativamente ridotti nei suoli biotrattati rispetto al controllo di incubazione e tale effetto era maggiormente evidente nel caso di B. rhodina. Un significativo aumento nei livelli di detossificazione

Ergosterolo (µg/g suolo) Proteine solubili (µg/g suolo) pH finale (in acqua/in 1N KCl) Controlli di incubazione Fumigato 0a 14,4±1,6a 7,67/7,51 Non fumigato 0a 32,5±2,0a 7,80/7,68 B. rhodina DABAC P82 Fumigato 0,8±0,1b 558,9±27,0b 7,25/7,68 Non fumigato 1,7±0,3c 677,2±56,2c 6,89/7,29 P. pulmonarius CBS 644.97 Fumigato 1,3±0,2d 810,6±31,1d 6,80/7,00 Non fumigato _0,2±0,0a 410,2±46,7e 7,48/7,84

era inoltre rilevabile nel caso dei suoli biotrattati non fumigati rispetto ai fumigati e, in particolare, nel caso di B. rhodina la tossicità era ridotta del 71,4% (Figura 4.12).

Studi precedenti hanno riportato la possibilità dell’instaurazione di effetti di tipo sinergico tra i funghi white-rot e la microflora indigena. Ad esempio, Mougin e collaboratori (1997) hanno dimostrato che la decontaminazione di un suolo, contaminato artificialmente da lindano, ed incubato con Phanerochaete crysosporium risultava sensibilmente maggiore nel suolo non sterile rispetto a quello sterile sebbene la crescita fungina era notevolmente ridotta nel primo caso. Il fungo era inoltre coinvolto nella modificazione del pathway degradativo del lindano dato che aumentava la degradazione degli intermedi chimici prodotti dalla microflora indigena durante la sua degradazione (Mougin et al., 1997).

La presenza di effetti sinergici tra funghi esogeni e microflora endogena, è stata anche evidenziata nel caso di suoli contaminati da idrocarburi policiclici aromatici (IPA). in der Wiesche e collaboratori (2003) hanno riportato, infatti, che la mineralizzazione del pirene da parte di Pleurotus ostreatus e Dichomitus squalens risultava maggiore in presenza dei batteri autoctoni così come Boonchan e collaboratori (2000) hanno dimostrato che l’inoculo misto, fungino e batterico, di un suolo aumentava significativamente la degradazione di IPA ad alto peso molecolare.

Oltre ad interazioni sinergiche, sono noti in letteratura anche effetti di tipo antagonistico o competitivo tra batteri e funghi in siti contaminati. Ad esempio, l’accumulo di prodotti terminali della degradazione di IPA da parte di P. ostreatus aveva un impatto negativo sulla microflora indigena (Andersson et al., 2003); precedentemente, era stato anche dimostrato il coinvolgimento di tale fungo nel ritardo e nella riduzione della deplezione di IPA in un suolo contaminato. In questo caso, molto probabilmente, tali effetti erano imputabili alla morte della maggior parte dei batteri che altrimenti avrebbero preso parte al processo degradativo (Gramss et al., 1999).

Tabella 4.5. Concentrazione dei diversi contaminanti nei controlli di incubazione fumigati e non fumigati, presi come riferimento, e percentuali di deplezione degli stessi nei suoli biotrattati con P. pulmonarius e B. rhodina, fumigati e non fumigati.

Figura 4.11. Peso totale dei contaminati organici (TWOC) nel controllo di incubazione e nei suoli biotrattati con B. rhodina e P. pulmonarius, fumigati e non fumigati. L’analisi statistica dei risultati è stata effettuata mediante test di Tukey: le barre d’errore sovrastate da lettere minuscole uguali, e dello stesso colore delle barre nell’istogramma, indicano assenza di differenze statisticamente significative (P<0,05) tra i diversi trattamenti dei suoli fumigati e non fumigati, mentre lettere maiuscole uguali indicano assenza di differenze statisticamente significative tra i suoli fumigati e non fumigati, trattati allo stesso modo.

Contaminante

Fumigato Non fumigato Fumigato Non fumigato Fumigato Non fumigato

Naphtalene 1,2 0,3 9,6 0,0 0,0 0,0 1,2,4,5-tetraclorobenzene 3,6 2,1 0,0 0,0 0,0 0,0 2,6-dicloroanilina 12,1 0,0 0,0 0,0 43,6 0,0 2,4-dicloroanilina 26,3 4,0 0,0 0,0 18,4 12,0 Difeniletere 7,2 10,6 0,0 28,0 0,0 0,0 o-idrossibifenile 9,8 18,5 0,0 51,7 80,0 97,5 2,6-dicloro-3-metilalanina 2,2 2,0 0,0 15,0 100,0 100,0 2,3,4,5,6-pentacloroanilina 12,3 11,1 5,2 53,2 11,5 20,0 1-chloro-9,10-antracenedione 3,3 3,1 0,0 42,6 13,9 32,9 1-ammin o-9,10-antracenedione 6,4 9,0 29,4 47,3 34,4 48,2 9,10-antracenedione 460,0 455,0 0,0 43,8 0,0 43,8 1,1'-binaftalene 0,0 7,8 0,0 48,1 0,0 100,0 7[H]-benzo[DE]-antracene-7-one 920,0 910,0 24,8 30,0 11,3 18,1

% di deplezione dei contaminanti