Analisi molecolar

3.8.1. Estrazione ed analisi degli acidi grassi derivati dai fosfolipidi:

L’analisi degli acidi grassi derivanti dai fosfolipidi (PLFA: Phospholipid Fatty Acid

Analysis) è stata effettuata al fine di valutare sia da un punto di vista qualitativo che

semiquantitativo le comunità microbiche residenti del suolo ACNA.

L’analisi è stata condotta seguendo il metodo riportato da White e collaboratori (1979) con alcune modifiche. Gli esteri metilici degli acidi grassi presenti nei fosfolipidi (FAME), derivati dalla metanolisi condotta in ambiente alcalino e presenti nella frazione metanolica, sono stati estratti con n-esano ed analizzati mediante gas cromatografia associata a spettrometria di massa (GC-MS), come descritto da Byss e collaboratori (2007). L’analisi GC-MS è stata condotta con il sistema GCQ (Finningan, Austin, USA) dotato di una trappola ionica collegata ad uno ionizzatore esterno.

Gli standard FAME sono stati ottenuti dalla Supelco (USA) e, in particolare, sono stati utilizzati come marker i lipidi di membrana (Elsas et al., 2007), che permettono sia il riconoscimento di gruppi batterici specifici che la distinzione tra batteri e funghi.

In particolare, i marker utilizzati erano i seguenti: acidi grassi ramificati terminalmente ( a, i), usati per il riconoscimento dei batteri Gram positivi; acidi grassi metilati nella porzione centrale della molecola (10Me18:0), utilizzati per la discriminazione degli Actinomiceti; acidi grassi con ramificazioni ciclopropiliche, impiegati per l’individuazione dei batteri Gram negativi; acidi grassi insaturi, in particolare acidi linoleico (18:2ω6,9) per la differenzazione dei funghi totali.

I batteri totali venivano quantificati dalla somma dei seguenti acidi grassi: i-15:0, a- 15:0, 15:0, 16:1ω7c, i-17:0, cy17:0, cy19:0.

3.8.2. Estrazione del DNA dai campioni di suolo:

Il DNA è stato estratto dai campioni utilizzando “PowerSoil DNA Extraction Kit” (MoBio Laboratories, USA) seguendo le istruzioni fornite dal produttore, con la sola modifica di un’ulteriore fase di lisi cellulare, oltre a quella prevista, riscaldando il campione a 70°C per 10 min. Il DNA è stato quantificato spettrofotometricamente misurando l’assorbanza dei campioni alla lunghezza d’onda di 260nm.

3.8.3. Amplificazione del gene ribosomiale 16S ed analisi DGGE:

Dal DNA metagenomico è stata amplificata la regione ipervariabile V3 del gene ribosomiale 16S utilizzando i primers: 341F (ATTACCGCGGCTGCTGG) e 534R (ATTACCGCGGCTGCTGG) (Muyzer et al., 1993) ottenendo un frammento di circa 200bp. All’estremità 5’ del primer 341F era legata una sequenza di circa 40 pb ricca in G e C detta GC-clamp necessaria a stabilizzare gli amplicons durante la separazione in DGGE.

Per ogni campione si utilizzava il seguente mix di reazione:  DNA template: 10 ng;

 illustra™ HotStart Master Mix (GE Healthcare, UK): 1X;  Forward primer: 0,4 µM;

 Reverse primer: 0,4 µM.

fase di annealing durante la quale la temperatura veniva ridotta di 0,5°C ad ogni ciclo partendo da 65°C fino a scendere a 55°C, temperatura alla quale venivano effettuati ulteriori 10 cicli.

Per ogni campione venivano effettuate reazioni di amplificazione in triplicato e i prodotti ottenuti venivano uniti e quindi concentrati con filtri Microcon Y-100 (Millipore, Bedford, MA) e separati su gel d’agarosio all’1,5% contenente etidio bromuro.

L’analisi DGGE dei frammenti è stata effettuata con il sistema INGENY phorU-2. (Ingeny International BV, Goes, NL). In particolare, per la corsa elettroforetica, è stato utilizzato un gel di poliacrilammide al 6% in TAE 0,5X (20mM Tris, 10 mM acetato, 0.5 mM Na2EDTA; pH 7.8) contenente un gradiente lineare di urea-formamide da 40 a 60% [dove: 100% corrisponde ad urea 7 M e formamide deionizzata 40% (v/v)].

La corsa elettroforetica è stata condotta per 16 ore a 100 V alla temperatura costante di 60°C. Il gel è stato colorato con SYBR Gold (Invitrogen) in TAE 1X a temperatura ambiente per 45 min e l’immagine è stata rilevata per mezzo di un transilluminatore UV dotato di macchina fotografica (ChemiDoc, BioRad).

3.8.4. Amplificazione del gene ribosomiale 18S ed analisi DGGE:

Il gene ribosomiale 18S è stato amplificato utilizzando la coppia di primers GCfungF(CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCC CGTTACCCGTTG) (May et al., 2001) e NS1R (GTAGTCATATGCTTGTCTC) (White et al., 1990). All’estremità 5’ del forward era legata la sequenza GC-clamp (sottolineata) necessaria a stabilizzare gli amplicons durante la separazione in DGGE. Per ogni campione si utilizzava il seguente mix di reazione:

 DNA template: 10 ng;

 illustra™ HotStart Master Mix (GE Healthcare, UK): 1X;  Forward primer: 0,8 µM;

 Reverse primer: 0,8 µM.

Le reazioni venivano condotte seguendo il programma termico riportato di seguito: l’iniziale denaturazione a 95°C per 3 min, era seguita da 35 cicli a 94°C per 30 sec, 55°C per 30 sec e 72°C per 1 min con estenzione finale a 72°C per 5 min.

L’analisi DGGE dei frammenti è stata effettuata utilizzando un gel di poliacrilammide all’8% in TAE 0,5X contenente un gradiente lineare di urea-formamide da 20 a 40%.

La corsa elettroforetica è stata condotta per 16 ore a 100 V alla temperatura costante di 60°C. Il gel è stato colorato con SYBR Gold (Invitrogen) in TAE 1X a temperatura ambiente per 45 min e l’immagine è stata rilevata per mezzo di un transilluminatore UV dotato di macchina fotografica (ChemiDoc, BioRad).

3.8.5. Analisi digitale e statistica dei profili DGGE:

L’analisi delle immagini relative alle corse elettroforetiche in DGGE veniva effettuata attraverso l’utilizzo del software Quantity-one image analysis (versione 4.2.5 Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) stimando la biodiversità delle specie batteriche o fungine nei diversi campioni attraverso i seguenti indici:

 Richness (S): numero di bande in ogni linea

 Indice di Shannon-Weaver (H) = -Σ(ni/N)log(ni/N),

dove:

ni = altezza del picco relativo ad ogni banda;

N = somma di tutti i picchi relativi alle bande di una linea.

Inoltre, attraverso l’analisi dell’immagine era possibile generare dei dendrogrammi sulla base della matrice di similarità calcolata utilizzando l’indice di Dice.

3.8.6. Costruzione e screening di librerie di clonaggio del gene ribosomiale 16S:

Il gene ribosomiale 16S è stato amplificato, in questo caso, utilizzando la coppia di primers 8F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) e 1507R (TACCTTGTTACGACTT; Dunbar et al., 2001).

Per ogni campione si utilizzava il seguente mix di reazione:  DNA template: 10 ng;

 illustra™ HotStart Master Mix (GE Healthcare, UK): 1X;  Forward primer: 0,8 µM;

 Reverse primer: 0,8 µM.

Le reazioni venivano condotte seguendo il programma termico riportato di seguito: l’iniziale denaturazione a 95°C per 3 min, era seguita da 30 cicli a 94°C per 1 min, 50°C per 45 sec e 72°C per 2 min con estenzione finale a 72°C per 15 min.

I prodotti di PCR venivano clonati utilizzando TOPO-TA cloning kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguendo le istruzioni fornite dal kit stesso e lo screening dei cloni

Screening per DGGE: i cloni venivano vagliati al fine di identificare le sequenze

corrispondenti a bande DGGE selezionate, seguendo il metodo proposto da Gonzalez e collaboratori (2003). In particolare, in una prima reazione di amplificazione si utilizzavano come template un pool di 5 colonie “picchettate” casualmente dalle piastre su cui venivano fatte sviluppare. Le colonie erano quindi sospese nel tampone utilizzato per la reazione di amplificazione, sottoposte a lisi a 95°C per 10 min ed, in seguito all’aggiunta dei primers (T3 e T7; 0,1 µM) dei dNTPs (0,25 mM) del MgCl2 (2,5 mM) e

della Taq-Polimerasi (0,02; Fermentas) venivano sottoposte ad amplificazione seguendo il profilo termico riportato di seguito: denaturazione iniziale a 95°C per 3 min, seguita da 30 cicli a 94°C per 1 min, 50°C per 45 sec e 72°C per 2 min con estenzione finale a 72°C per 15 min. Questo primo step di amplificazione era effettuato al fine di estrarre l’inserto dal plasmide contenuto nelle cellule ospiti, escludendo però dall’amplificazione il gene ribosomiale 16S delle stesse.

La regione V3 di questo pool di colonie veniva quindi amplificata attraverso una

nested PCR in cui si utilizzava la coppia di primers 341F - 534R secondo le modalità

descritte precedentemente. Una prima analisi DGGE veniva effettuata quindi sui prodotti di PCR ottenuti confrontando la loro migrazione con le bande originatesi dall’amplificazione del DNA metagenomico dei campioni originali, utilizzate come riferimento.

Da questa prima corsa venivano selezionati i pool di cloni contenenti il maggior numero di bande co-migranti con quelle di riferimento. Tali colonie venivano quindi sottoposte, separatamente ai due step di amplificazione, descritti sopra, e successivamente analizzati in DGGE al fine di confermare la similarità di migrazione con le bande derivate dai campioni originali.

Screening per RFLP: l’inserto contenente il gene ribosomiale 16S veniva estratto

dal plasmide attraverso una reazione di amplificazione in cui si utilizzava come

template un una colonia “picchettata” casualmente dalle piastre su cui venivano fatti

sviluppare i cloni derivati dalle librerie di clonaggio. La colonia era sospesa nel tampone utilizzato per la reazione di amplificazione, sottoposta a lisi a 95°C per 10 min e, quindi, la regione contenente l’inserto veniva amplificata utilizzando i primers del vettore, T3 e T7 impiegando lo stesso mix di reazione e lo stesso profilo termico descritto precedentemente per il primo step di amplificazione.

I prodotti di PCR ottenuti venivano purificati utilizzando QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) e 15 µl degli stessi erano sottoposti a digestione con 5U dell’enzima di restrizione HaeII (Roche) a 37°C per 2h.

I frammenti ottenuti dalla digestione venivano separati su gel d’agarosio al 2,5% contenente etidio bromuro e quindi, i cloni da cui si ottenevano profili differenti venivano selezionati per il successivo sequenziamento.

3.8.7. Estrazione del DNA plasmidico, sequenziamento, editing ed allineamento delle sequenze:

Il DNA plasmidico dei cloni di nostro interesse è stato estratto utilizzando QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) seguendo le istruzioni fornite dal produttore del kit.

Gli inserti sono stati amplificati in entrambe le direzioni, utilizzando i primers T3 e T7 attraverso il servizio fornito da MWG.

Le sequenze ottenute sono state editate ed allineate attraverso le applicazione del software Lasergene e quindi confrontate con quelle depositate nelle banche dati GenBank ed RDP al fine di ottenere una loro assegnazione tassonomica.

3.8.8. PCR Quantitativa:

Attraverso qRT-PCR è stata effettata una quantificazione relativa del gene ribosomiale 16S, e dei geni funzionali nahAc, NAH (codificanti 2 diverse classi di naftalene-diossigenasi), BPH (codificante la bifenil-diossigenasi) e C-230 (codificante la catecolo 2,3-diossigensi). In tabella 3.6 vengono riportate le sequenze, le concentrazioni alle quali venivano utilizzati per ogni reazione, le temperature di

annealing (Ta) e gli autori dai quali sono stati riportati i primers utilizzati nelle reazioni

Tabella 3.6. Principali caratteristiche dei primers utilizzati in qRT-PCR.

Primers Target Sequenza

Concentrazione dei Primers utilizzata (µM) Ta (°C) References 341F CCTACGGGAGGCA GCAG 0,05 534R A TTACCGCGG CTG CT GG 0,9 nahAc_f TGG CGATGAAGAACTT TTCC 0,2 nahAc_r AACGTACGCTGAACCGAGTC 0,2 NA H-F CAAAARCACCTGA TTYAT GG 0,3 NA H-R A YRCGRGSGACTTCTTTCAA 0,3

BPH3-F CCGGGAG AACG GCAGGATC 0,4

BPH3-R T GCTCCGCTGCGAACTTC 0,4 C2 30_f A AGAGGCATGGGGGCGCACCGGTTCGATCA 0,2 C2 30_r CCAGCAAACACCTCGTTG CGGTTGCC 0,2 57 55 55 47 60 Sei et al., 1999 Muyzer et al., 1993

Park & Cro wley, 2006

Bifenil-diossigenasi

Baldwin et al., 2003

Baldwin et al., 2003 Naftale-diossigenasi

Naftale-diossigenasi regione V3 del 6S rDNA

Catecolo 2,3-diossigenasi

Ogni reazione veniva condotta in un volume finale di 25 µl contenente:  7,5 µl di template;

 12,5 µl di 2X SYBR Green JumpStart Taq mix (Sigma).

 7,5 µl di ognuno dei primers opportunamente diluito al fine di raggiungere la concentrazione finale riportata in tabella 3.6.

Le reazioni venivano condotte seguendo il programma termico riportato di seguito: l’iniziale denaturazione del template a 95 °C per 5 min era seguita da 50 cicli a 94°C per 20 sec, Ta (riportata in tabella 3.6) per 20 sec e 72°C per 30 sec. L’analisi dei dati è stata effettuata attraverso il software iCycler (versione 3.0; BioRad); ogni risultato veniva espresso come “fold” rispetto al valore di Ct (Ciclo soglia) di ogni campione all’inizio dell’incubazione e riportato come logaritmo.