Analisi dei dati statistic

Alle U.O. di Laboratorio della AOUP afferiscono ogni anno decine di migliaia di prelievi per indagini microbiologhe. Tali prelievi provengono, in massima parte, dalle U.O. del Nosocomio pisano ed in parte dall’utenza esterna, attraverso i due punti di “Centro Prelievi” aperti alla cittadinanza dell’area Pisana. La tipologia delle indagini microbiologiche fa si che non tutti i campioni siano destinati alla ricerca dei miceti, così come non tutti i tipi di prelievo si possano ritenere idonei per tali indagini. Il Laboratorio di microbiologia offre ai clinici un ampio ventaglio di metodiche, alcune delle quali sono specifiche per un solo microrganismo o prevedono la ricerca di tossine piuttosto che di antigeni. I prelievi esterni destinati ad indagini microbiologiche e segnatamente richiesti per la ricerca di miceti sono relativamente pochi ed apportano un contributo pressoché irrilevante alla messe di miceti isolati ed identificati.

Negli anni 2005 e 2006, alle U.O. di Microbiologia della AOUP, sono pervenuti complessivamente un numero totale di 66396 campioni biologici diversi destinati alla ricerca di batteri e miceti (Tabella13). Alcuni materiali biologici rivestono un

Tabella 13. Riepilogo dell’attività di ricerca per miceti lievitiformi N. campioni: numero dei campioni ricevuti;

Positivi: numero dei campioni risultati positivi per funghi e/o batteri;

% Pos.: percentuale di positività;

Mic. Isolati: numero dei miceti lievitiformi isolati;

Mic/Camp: percentuale di positività di miceti lievitiformi sul totale degli inviati; Mic/Pos: percentuale di positività di miceti lievitiformi rispetto al numero dei campioni risultati positivi.

2005-2006 Materiali inviati e percentuale di positività generali e per miceti lievitiformi

Materiale

N.

campioni Positivi % Pos. Mic. Isolati Mic/Camp Mic/Pos

Ascitico 686 288 42% 57 8,3% 20% Aspirati 271 135 50% 29 10,7% 21% Auricolare 55 44 80% 5 9,1% 11% Bile 689 429 62% 29 4,2% 7% Broncoaspirato 2686 1817 68% 720 26,8% 40% Catetere 1527 252 17% 99 6,5% 39% Cutaneo 495 422 85% 40 8,1% 9% CVC 657 354 54% 37 5,6% 10% Emocoltura. 20617 2691 13% 169 0,8% 6% Espettorato 2738 1846 67% 752 27,5% 41% Essudato 101 77 76% 11 10,9% 14% Ferita 710 496 70% 63 8,9% 13% L. Bronchiale 1115 523 47% 152 13,6% 29% Liquor 243 67 28% 9 3,7% 13% Oculare 259 91 35% 6 2,3% 7% Pleurico 268 31 12% 1 0,4% 3% Seminale 1610 994 62% 6 0,4% 1% Uretrale 2264 1930 85% 13 0,6% 1% Urinocoltura 27000 4385 16% 2 0,0% 0% Vaginale 2405 1474 61% 182 7,6% 12% Materiali Vari 17 Totale 66396 18346 28% 2399 3.6% 13%

maggiore interesse e, soprattutto, hanno un maggior significato diagnostico rispetto ad altri. Come noto, alcune specie di miceti sono commensali del corpo umano o stabiliscono rapporti di colonizzazione. Nell’analisi dei risultati, è doveroso tener conto di tali fattori, integrando il nudo dato numerico relativo alla quantità degli

invii, con la significatività intrinseca del prelievo. Come mostrato in Tabella 13, la tipologia ed il numero dei campioni varia notevolmente. Possiamo osservare che, sia il liquido seminale che il tampone uretrale, a fronte di una percentuale di positività elevata, presentano un numero di miceti isolati veramente esiguo. A questo si aggiunga che tali materiali sono quasi esclusivamente di provenienza esterna. Viceversa, nei materiali di “elezione” per la ricerca dei funghi, quali quelli provenienti dalle via aeree, l’incidenza dei miceti è notevolmente superiore. Una nota per il materiale “Liquido Pleurico”. Dei 268 inviati, soltanto uno è risultato positivo, a testimonianza che se i miceti riescono a colonizzare frequentemente il tratto orofaringeo o il canale gastroenterico, così come il parenchima polmonare, hanno solitamente via preclusa alla cavità toracica e mediastinica.

La letteratura scientifica relativa alla frequenza di isolamento di miceti (Da Matta et al., 2003), (Kuriyama et al., 2005), (Fleck et al., 2007), (Mokaddas et al., 2007) dimostra che Candida albicans è la specie più frequentemente isolata, con percentuali che oscillano tra il 60 e il 70%. Nel presente studio, dei 2399 miceti lievitiformi isolati ed identificati, 1620 appartenevano alla specie C. albicans con una percentuale del 67.5% (Tabella 14). A seguire, C. glabrata 13.5%, C. tropicalis 4.8%, C. parapsilosis 4.6%, C. krusei 2.6%. Altre specie di Candida, così come miceti appartenenti ad altri generi, sono stati isolati molto più raramente. Tale risultato, però, non deve indurre a sottovalutare questi isolamenti abbastanza rari. A fronte, infatti, di una esigua rappresentatività, alcune specie definite “minori”, possono mostrare elevate resistenze alle molecole antifungine. Ciò rappresenta un problema che tanto il laboratorista quanto il clinico non debbono sottovalutare in alcun modo.

Nella verifica dei risultati relativi alla provenienza dei campioni, abbiamo potuto osservare che alcuni materiali erano di provenienza quasi esclusiva dei Centri Prelievo a servizio dell’utenza esterna. Essendo lo scopo di questa tesi valutare l’incidenza di isolamento di miceti in ambito nosocomiale, abbiamo ristretto

Tabella 14 Specie di miceti lievitiformi isolati negli anni 2005-6

2005-6 Specie isolate in tutti i materiali pervenuti e relativa rappresentatività %

Specie Isolati % Specie Isolati %

C. albicans 1620 67,5% C. guilliermondii 7 0,3%

C. glabrata 325 13,5% C. pelliculosa 6 0,3%

C. tropicalis 115 4,8% Geotr. Capitatum 6 0,3%

C. parapsilosis 111 4,6% C. rugosa 4 0,2%

C. krusei 65 2,6% Rhodorotula mucillaginosa 4 0,2%

Saccaromyces cerevisiae 32 1,3% Trichosporon asahii 4 0,2%

C. famata 23 1,0% C.pulcherrima 2 0,1%

Stephanoascus ciferrii 11 0,5% C. catenulata 1 0,0%

C. dubliniensis 10 0,4% C. haemulonii 1 0,0%

C. kefir 10 0,4% C. intermedia 1 0,0%

C. lusitaniae 10 0,4% C. magnoliae 1 0,0%

C. norvegensis 10 0,4% C sake 1 0,0%

C. sphaerica 10 0,4% C. zeylanoides 1 0,0%

Cryptococcus laurentii 10 0,4% C. valida 1 0,0%

Totale 2399

il campo delle osservazioni ai funghi isolati esclusivamente da materiali biologici provenienti dalle U.O. della AOUP. Per far questo è stato deciso di elidere il contributo relativo ai materiali: tampone auricolare, tampone cutaneo, tampone oculare, liquido seminale, tampone uretrale, urine e tampone vaginale, dato l’esiguo apporto assoluto e percentuale al numero degli isolati. Focalizzando l’attenzione sui materiali più “significativi” ai fini della nostra indagine, è stato possibile collegare più agevolmente i dati di Laboratorio con quelli anamnesici relativi ai pazienti o alle patologie. Inoltre, nella verifica delle sensibilità e resistenze alle molecole antifungine dei ceppi isolati, considerare solamente i dati relativi ai pazienti ricoverati ha permesso di normalizzare le considerazioni relative alla terapia, conosciuta e in buona misura standardizzata all’interno del nosocomio, sconosciuta e probabilmente più variabile per l’utenza esterna.

Riunendo come Candida spp. tutti i ceppi di C. kefyr, C. rugosa, C. incospiqua, C. norvegensis, C. lusitaniae, C. sphaerica e C zeylanoides, raramente isolati, abbiamo diagrammato tutti i miceti di provenienza nosocomiale in relazione ai materiali di origine. Come mostrato in Tabella 15, le percentuali assolute di

Tabella 16 Specie isolate nei materiali di provenienza nosocomiale

Nelle righe relative ad ogni singolo materiale,è presente sia il valore assoluto del numero degli isolati, sia tra parentesi, il valore percentuale all’interno della tipologia di prelievo.

Miceti lievitiformi isolati

C. albica. C. glabr. C. krusei C. parap. C. tropic. C. famata C. pellic. S. ciferrii C.ssp. Totale

Materiali Ascitico 36 (63) 9 (16) 1 (1.7) 3 (5.2) 3 (5.2) 0 0 0 5 (8.7) 57 Aspirati 13 (45) 7 (24) 1 (3.4) 0 2 (6.8) 0 0 1 (3.4) 5 (17.2) 29 Bile 23 (79) 2 (6.8) 1 (3.4) 0 1 (3.4) 0 0 0 2 (6.8) 29 B. aspirato 482 (67) 102 (14) 18 (2.5) 28 (3.9) 36 (5) 10 (1.4) 4 (0.5) 5 (0.7) 35 (4.9) 720 Catetere 49 (49) 25 (25) 5 (5) 8 (8) 2 (2) 1 (1) 0 3 (3) 6 (6) 99 CVC 24 (64) 3 (8.1) 1 (2.7) 2 (5.4) 4 (11) 1 (2.7) 0 0 2 (5.4) 37 Emocoltura 84 (52) 9 (5.5) 7 (4.3) 39 (24) 12 (7.4) 4 (2.5) 0 0 7 (4.3) 162 Espettorato 574 (76) 91 (12) 19 (2.5) 5 (0.6) 42 (5.5) 0 0 1 20 (2.6) 752 Essudato 8 (72) 1 ( 9) 0 1 (9) 0 0 0 0 1 (9) 11 Ferita 33 (53) 13 (21) 8 (12.6) 1 (1.5) 5 (8) 2 (3) 0 0 1 (1.5) 63 L. Bronch. 104 (68) 37 (24) 4 (2.6) 2 (1.3) 5 (3.2) 0 0 0 0 152 Liquor 5 (56) 0 0 2 (22) 2 (22) 0 0 0 0 9 Pleurico 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 Totale 1436 299 65 91 114 18 4 10 84 2121 % (67,7) (14) (3) (4,3) (5.3) (0,8) (0,3) (0,5) (3,9)

rappresentatività totale delle varie specie subiscono irrilevanti variazioni. Nelle ultime due righe della tabella, è stato riportato il numero totale di isolati suddivisi per specie e la rappresentatività percentuale rispetto al totale dei ceppi identificati (n = 2121). C. albicans è risultata ancora la specie più isolata (67.7%).

Nei campioni di espettorato, C. albicans non è solo sia il fungo più frequentemente isolato, ma mostra anche la percentuale di rappresentatività più elevata rispetto a tutti gli altri materiali. Altre specie di Candida, invece, sono isolate con frequenza percentualmente più significativa in campioni biologici diversi: C. glabrata nei cateteri (25%), C. parapsilosis nelle emocolture (24%), C. krusei in “Ferita” (12.6%). Questa valutazione, basata sulla percentuali di isolati, induce a pensare che, all’interno del nostro nosocomio, i miceti lievitiformi, in dipendenza delle patologie, possano trovare particolari nicchie ecologiche e condizioni ideali per il loro sviluppo. E’ stato ormai stabilito che molte specie di Candida hanno la capacità di produrre un biofilm extracellulare che le rende particolarmente inattaccabili dalle comuni terapie e, soprattutto, conferisce loro la capacità di aderire molto saldamente a dispositivi medici bio protesici (Baillie et al., 1999; Chandra et al., 2001; Song et al., 2004; Tumbarello et al., 2007). I campioni clinici analizzati in questo lavoro provengono in buona parte da pazienti ricoverati in reparti di terapia intensiva (UTI) o U.O. di alta specializzazione nelle quali sono ricoverati pazienti con patologie gravi, quali neoplasie o insufficienze funzionali di parenchima. E’ spesso necessario che, nel decorso del ricovero, questi pazienti siano sottoposti al posizionamento di cateteri venosi centrali (CVC), cateteri a permanenza, cannule tracheali per la respirazione assista o cannule di drenaggio. Tutti questi materiali sono ormai entrati in modo stabile nella pratica medico chirurgica ma costituiscono, comunque, potenziali porte di accesso ai microrganismi. La capacità di alcune specie del genere Candida di produrre biofilm rende particolarmente vulnerabili queste vie d’accesso. Non è infrequente, infatti, che pazienti portatori di CVC o cateteri a permanenza manifestino sintomatologie tali per cui si necessitano indagini microbiologiche. Spesso, nei materiali inviati, viene rilevata la presenza di miceti produttori di biofilm. E’ dunque comprensibile come la capacità di adattamento dei miceti lievitiformi a nuovi ambienti colonizzati possa creare notevoli problemi da un punto di vista infettivo. L’invio dei campioni biologici ai Laboratori di microbiologia corrisponde certamente ad una reale esigenza diagnostica, ma spesso alcune tipologie di campioni vengono inviate perché la ricerca dei microrganismi è inserita in un percorso o protocollo di screening. Analizzando, per esempio, i dati relativi ai

campioni di espettorato e broncoaspirato, è stato evidenziato che questi hanno apportato, negli anni 2005-06, il maggior contributo quantitativo all’isolamento di miceti lievitiformi. Data la capacità dei funghi di colonizzare le alte vie aeree, resta abbastanza difficile attribuire ai 752 ceppi isolati nei campioni di espettorato una reale significatività clinica. Diverse considerazioni devono essere fatte per i broncoaspirati. Si tratta infatti di prelievi eseguiti dietro formulazione di un quesito clinico ben preciso, ma anche come indice per il monitoraggio delle eventuali insorgenze di polmoniti. I pazienti ricoverati nelle UTI sono sovente sottoposti a ventilazione assistita. Questa condizione è un fattore predisponente assai importante per l’insorgenza di fenomeni infettivi. I protocolli di sorveglianza prevedono dunque che ai pazienti delle UTI siano prelevati, con cadenza almeno bisettimanale, prelievi di broncoaspirato da destinare all’indagine microbiologica. Anche in questo caso, è abbastanza difficile collegare direttamente i 720 ceppi di miceti lievitiformi a patologie polmonari conclamate. L’alta percentuale di positività del campione broncoaspirato, 26.8% rispetto al totale degli inviati, è da correlare certamente alla presenza di materiale protesico per favorire la respirazione assistita, ma non necessariamente ad episodi di polmoniti o bronco polmoniti causate da funghi.