Farmacoresistenza dei ceppi isolati dalle emocolture

Come osservato dai risultati sulla frequenza di isolamento delle diverse specie di lieviti, alcune specie sono più rappresentate in alcuni campioni biologici piuttosto che in altri. Avendo preso in considerazione le emocolture, come prelievo ad alta specificità per il monitoraggio delle infezioni fungine sistemiche, abbiamo deciso di valutare le percentuali di sensibilità per gli isolati da questo tipo di materiale.

La percentuale di ceppi di Candida parapsilosis isolati dalle emocolture è risultato più elevato rispetto alla media generale ed analoga tendenza si riscontrava anche per le altre specie di Candida non albicans. Anche se alcune specie presentavano un numero di isolati veramente esiguo, si è deciso di diagrammare gli schemi di sensibilità per tutti i ceppi, per offrine una panoramica esaustiva. Analogamente a quanto osservato in precedenza, i ceppi di Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida tropicalis isolati dalle emocolture non mostrano significativa farmacoresistenza (Tabella 22). Al contrario, Candida glabrata e Candida krusei presentano elevate resistenze agli Azoli. Per ciò che riguarda il Voriconazolo, i ceppi di queste due specie isolati dalle emocolture hanno mostrato una riduzione di sensibilità, riduzione non evidenziata nei ceppi isolati da altri campioni. L’unico ceppo di C. norvegensis isolato è risultato resistente a tutte le molecole saggiate ad eccezione del Voriconazolo.

Tabella 22. Sensibilità agli antimicotici di ceppi isolati dalle emocolture

FC = 5 Fluorocitosina IZ = Itraconazolo AB = Amfotericina B VOR = Voriconazolo FZ = Fluconazolo

2005-6 % di sensibilità di miceti isolati da Emocolture tra parentesi il numero di ceppi testati

Specie FC AB FZ IZ VOR C. albicans ( 84 ) 100% 100% 100% 100% 100% C. parapsilosis ( 39 ) 100% 100% 89% 94% 100% C. tropicalis ( 12 ) 100% 100% 100% 100% 100% C. glabrata ( 9 ) 100% 100% 11% 11% 77% C. krusei ( 7 ) 50% 100% 14% 14% 60% C. famata ( 4 ) 100% 100% 100% 100% 100% C. pulcherrima ( 2 ) nt 100% 100% 50% 100% C. catenulata ( 1 ) 100% 100% 100% 100% 100% C. norvegensis ( 1 ) 0% 0% 0% 0% 100% C. laurentii ( 1 ) 100% 100% 100% 100% 100% T. asahii ( 2 ) 100% 100% 100% 50% 100%

3.6 Caspofungina

La Caspofungina è una molecola antifungina ad ampio spettro, appartenente ad una nuova classe farmaceutica, le echinocandine. Questo farmaco, blocca la sintesi della parete cellulare inibendo la sintesi del beta 1,3-D-glucano, componente essenziale della parete di molti funghi filamentosi e lieviti. La Caspofungina non compare, di norma, nei referti di poiché il CLSI non ha ancora reso noti i valori di breakpoint per poter interpretare i test di sensibilità. E’ comunque possibile, sia con YEAST ONE che con E Test, valutare le MIC relative a questo antimicotico quando cimentato coi diversi ceppi di funghi, ma non è possibile interpretare tali valori di MIC assegnando ad essi il termine S, R o I. Nonostante ciò, in via sperimentale,

abbiamo valutato i valori di MIC della Caspofungina nei confronti di alcuni ceppi di miceti. La metodica prescelta è stata quella dell’E Test.

Sono stati saggiati 57 ceppi di miceti lievitiformi, in prevalenza appartenenti a Candida spp. e tre ceppi di T. asahii. Ad eccezione di un isolato di T. asahii, tutti gli altri ceppi saggiati erano stati isolati da campioni di emocoltura pervenuti al Laboratorio nell’anno 2006. Per verificare l’efficacia di Caspofungina, abbiamo diagrammato i risultati in modo da evidenziare la percentuale dei ceppi sensibili a vari gradienti di MIC, rispetto al numero totale degli stipiti in esame (Tabella 23). Tutte le specie di Candida, ad esclusione di C. parapsilosis, sono risultate sensibili con una MIC al di sotto o uguale a 1 μg/ml. I ceppi di C. parapsilosis raggiungono il 100% di sensibilità, solo ad una MIC di 8 μg/ml. Dei 18 ceppi di C. parapsilosis saggiati, 15 provenivano dai campioni di emocoltura inviati dalla U.O. di Neonatologia.

Tabella 23. Percentuali di sensibilità di lieviti per la Caspofungina

2005-6 57 Ceppi testati con Caspofungina,

Specie % di sensibilità alle varie mic (mg/ml)

0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 24 C. albicans (23) 73% 91% 100% C. parapsilosis (18) 0% 11% 50% 66% 72% 88% 100% C. glabrata (5) 60% 60% 80% 100% C. krusei (4) 25% 100% C. tropicalis (3) 33% 66% 100% C. pulcherrima (1) 100% T. asahii (3) 0%

3.7 Isolamento di ifomiceti

Anche se l’obiettivo principale di questa tesi era quello di valutare l’epidemiologia dei miceti lievitiformi e le percentuali di sensibilità di questi ai farmaci antifungini, durante i due anni di osservazione sono stati isolati in Laboratorio anche miceti filamentosi appartenenti a specie diverse. Ad eccezione di

occasionali isolamenti da materiali biologici diversi, la quasi totalità degli isolati proveniva da campioni respiratori. L’isolamento di ifomiceti in materiali come l’espettorato deve essere immediatamente segnalato al Reparto di provenienza, data l’elevata patogenicità di molte specie.

I risultati relativi agli ifomiceti indicano che tali funghi sono sicuramente più rari rispetto ai miceti lievitiformi; nonostante ciò, in alcuni materiali, come l’espettorato, la percentuale di positività non è trascurabile (Tabella 24).

Tabella 24. Percentuale di positività per miceti lievitiformi

2005-6 Ifomiceti isolati in campioni positivi

Materiali Positivi Isolati %

Broncoaspirato 1817 23 1,3% Espettorato 1846 79 4,3% L. Bronchiale 523 12 2,3% Totale 4186 114 2,7%

Analizzando i materiali biologici di provenienza dal tratto respiratorio, è stato evidenziato che Apergillus fumigatus è la specie più frequentemente isolata (Tabella

25).

Tabella 25. Numero di isolamenti di ifomiceti da campioni

provenienti dal tratto respiratorio

2005-6 Specie di ifomiceti isolati dalle vie aeree

B. aspirato Espettorato L. Bronchiale Totale %

A. fumigatus 15 35 6 56 49,1% A. flavus 2 8 0 10 8,8% A. niger 2 10 4 16 14,0% A. terreus 2 3 1 6 5,2% A. versicolor 1 3 0 4 3,5% A. species 0 1 0 1 0,8% Penicillium ssp. 0 9 1 10 8,8% Alternaria ssp. 0 4 0 4 3,5% Fusarium ssp. 0 3 0 3 2,6% Acremonium 1 0 0 1 0,8% Scopulariopsis 0 3 0 3 2,6% Totale 23 79 12 114

I risultati relativi alla frequenza di isolamento di ifomiceti, sia pur esigui, vanno rapportati all’epidemiologia generale dei miceti nel nosocomio Pisano. Ad una analisi superficiale, infatti, la frequenza assoluta poteva far pensare ad isolamenti sporadici. Nonostante ciò, ad una analisi più accurata del numero assoluto degli isolamenti di ifomiceti e lieviti è emerso che le specie di Aspergillus e di Candida vengono isolate con una simile frequenza dai materiali respiratori (Tabella 26).

Tabella 26. Numero di isolamenti di ifomiceti e lieviti da campioni

provenienti dal tratto respiratorio

2005-6 isolati per ifomiceti e lievitiformi

B. aspirato Espettorato L. Bronchiale

A. fumigatus 15 35 6 A. flavus 2 8 0 A. niger 2 10 4 C. krusei 18 19 4 C. tropicalis 36 45 5 C. parapsilosis 28 5 5

4. DISCUSSIONE

Dai dati dell’Istituto Superiore di Sanità è emerso che, nel nostro Paese, le infezioni causate dai funghi sono incrementate del 500% dal 1980 al 1992 e la loro incidenza, stimata nel 2002, si aggira su 3.5 casi per 100.000 persone. L'utilizzo di trattamenti medici e chirurgici più aggressivi, dell'immunoterapia, il sempre più largo uso del catetere venoso e della nutrizione parenterale, nonché il frequente ricorso ai trapianti hanno fatto aumentare la popolazione dei pazienti immunodepressi ad alto rischio di contrarre una infezione fungina.

Il presente lavoro di tesi ha avuto lo scopo di valutare i) l’epidemiologia delle infezioni fungine nell’area Pisana negli anni 2005-2006, con particolare riguardo alle infezioni in pazienti ricoverati nei diversi reparti della Azienda Ospedaliero Universitaria Pisana; ii) l’incidenza di infezioni fungine sistemiche; e iii) la suscettibilità dei lieviti isolati verso i più comuni farmaci utilizzati nella terapia antimicotica.

La valutazione della frequenza totale di isolamento di miceti lievitiformi, ha evidenziato che Candida albicans è il fungo prevalentemente isolato, con un totale di 1620 ceppi su 2399 isolati (67.5%). Analoghi risultati sono stati ottenuti valutando l’incidenza di isolamento di lieviti da campioni provenienti da pazienti ricoverati nel nosocomio Pisano. Candida albicans, con 1436 isolati su 2121 (67.7%) è risultato il lievito più isolato, seguito C. glabrata (14%), C. tropicalis (5.3%), C. parapsilosis, (4.3%) e C. krusei (3%). Questi risultati sono simili a quelli descritti recentemente in studi epidemiologici nazionali (Bassetti et al., 2007) ed internazionali (Colombo et al., 2007). Nonostante ciò, è da considerare il fatto che numerose variabili possono influenzare i risultati di uno studio epidemiologico. Secondo alcuni autori, infatti, massive terapie antimicotiche utilizzate in alcuni nosocomi possono determinare pressioni selettive tali da favorire lo sviluppo e l’incremento di specie resistenti agli azoli, come C. glabrata e C. krusei, modificando notevolmente l’incidenza di isolamento di alcune specie (Wingard et al., 1995). Quello che più incide, però, sui

dati epidemiologici ottenuti in ospedali di grandi dimensioni sono la tipologia delle cliniche presenti e le patologie trattate. Dai dati in nostro possesso ci possiamo rendere conto che alcuni materiali biologici presentano una percentuale di positività per i miceti, notevolmente superiore alle altre. E’ risaputo che alcuni distretti corporei sono più facilmente colonizzati dai funghi rispetto ad altri. Osservando i 2738 campioni di espettorato inviati e verificato che da essi sono stati isolati 752 ceppi di miceti, con una percentuale di positività del 27.5%, ci si può interrogare sul significato clinico di tale esame. Allo stato attuale non è dato sapere se ai 752 isolamenti sia seguita la somministrazione di una terapia. Al Laboratorio inoltre non arrivano mai o comunque raramente, informazioni relative alla situazione clinica dei pazienti. Non è possibile dunque affermare se ai 752 isolamenti di miceti dal campione espettorato, siano corrisposti quadri infettivi, di semplice colonizzazione o addirittura fenomeni di inquinamento del campione. Tra l’altro nel campione espettorato, si rileva con un contributo di 574 ceppi su 752 ( 76.3% ), la più alta frequenza di isolamento per Candida albicans rispetto a tutti gli altri materiali. Sarebbe auspicabile si potesse implementare il passaggio delle informazioni, al fine di avviare un processo di valutazione multi disciplinare, per stabilire l’effettivo significato diagnostico di un campione come espettorato.

Le infezioni fungine invasive, ossia le infezioni sistemiche non superficiali localizzate nei vari distretti dell’organismo, seppur ritenute piuttosto rare, hanno però un’incidenza notevole sui pazienti gravemente immunodepressi, cioè senza di difese immunitarie. È significativa, in particolare, la percentuale di mortalità, che può variare tra il 30 e il 90 per cento in determinati pazienti, come i trapiantati di organo solido e midollo osseo, i soggetti con leucemia acuta o tumori solidi.

A fianco di funghi appartenenti al genere Candida, molto rappresentati nella nostra indagine, emergono valori esigui ma significativi di isolati di specie diverse. Cryptococcus laurentii 10 isolati, Rhodorotula mucillaginosa 4 isolati e Trichosporon asahii 4 isolati, rappresentano percentualmente lo 0.2 – 0.4%. Eppure tali sporadici isolamenti non sono da sottovalutare. Le pressioni selettive imposte dalle terapie antimicotiche, tendono frequentemente ad alterare i rapporti percentuali di isolamento, favorendo specie di Candida non albicans, ma evidentemente

concorrono anche a creare ideali opportunità per questi isolati emergenti. Difficile attribuire un significato clinico ai 32 ceppi ( 1.3% ) di Saccaromyces cerevisiae, tutti isolati in campioni provenienti dalle vie aeree, soprattutto in espettorato. Anche questo dato, certamente non preoccupante da un punto di vista infettivo, dovrebbe far riflettere su quelle che sono le procedure di esecuzione, accettazione – validazione dei prelievi destinati ad indagini microbiologiche.

Sempre in relazione ai materiali biologici prelevati dalle alte vie aeree, sono da segnalare 114 isolati di ifomiceti, prevalentemente appartenenti al genere Aspergillus. Anche se spesso è difficile stabilire una correlazione eziopatogenetica, questi isolamenti, spesso considerati come “inquinamenti occasionali”, non sono assolutamente da trascurare. Oltretutto l’attenzione focalizzata alle specie di Candida non albicans resistenti agli azoli, fa forse sottovalutare l’entità del fenomeno relativo agli isolamenti degli ifomiceti. Se prendiamo il campione broncoaspirato, possiamo notare come Candida krusei sia presente con 18 isolati, ma come Aspergillus fumigatus sia stato isolato 15 volte. Essendo il broncoaspirato un campione “protetto”, questi isolati di Aspergillus, non si possono sicuramente considerare inquinamenti ambientali. Purtroppo data la scarsità di informazioni, al Laboratorio non giunge notizia del fatto che all’isolamento di tali microrganismi siano correlabili ad eventi infettivi reali, o a semplici colonizzazioni. Questi informazioni, considerate accessorie, sarebbero invece di fondamentale importanza per inquadrare correttamente e correlare in modo inequivocabile, i dati relativi alla epidemiologia.

I dati risultanti dal nostro studio, forniscono spunti di osservazione importanti, ma non è sempre possibile stabilire rapporti eziopatogenetici corretti, semplicemente analizzando l’epidemiologia generale. L’esame che più di tutti può fornire indicazioni precise e permettere correlazioni corrette tra la clinica e la diagnostica di laboratorio, è senza dubbio l’emocoltura. Con 169 isolati su 20617 campioni inviati l’esigua percentuale di positività ( 0.8% ) potrebbe far apparire questo dato quasi trascurabile. Invece i 169 casi di sepsi accertata causata da miceti, corrisponde nel nostro Nosocomio ad 1.6 nuovi casi per ogni settimana di degenza. Se osserviamo le percentuali di isolamento per il campione emocoltura vediamo che Candida albicans rappresenta con 84 isolati solo il 51.8%, mentre C. parapsilosis

con 39 isolati sale al ( 24% ). Tale dato statistico trova ampio riscontro in analoghi studi nazionali (Luzzati et al., 2005 - Bassetti et al., 2006 – Bedini et al., 2006), mentre più complessa appare la comparazioni con studi effettuati in altre nazioni. Si può comunque verificare in letteratura, come nei campioni di emocoltura, non si rilevino percentuali di isolamento per Candida albicans al di sopra del 55%. Le restanti quote percentuali, presentano però un’ampia variabilità di distribuzione tra C. parapsilosis, C. glabrata e C. tropicalis. Un dato pienamente concordante con la letteratura (Tortorano et al., 2006) è quello che focalizza l’attenzione sui pazienti agli estremi dell’arco vitale. Neonati ed anziani, evidentemente per ragioni immunologiche, risultano percentualmente i soggetti più frequentemente colpiti da episodi infettivi imputabili a funghi. Anche nel nostro Ospedale il dato che emerge dalla U.O. di Neonatologia con 27 casi su 162 (16.7%), lo conferma come il Reparto con la più alta percentuale di positività nel campione emocoltura. In questo Reparto si rileva anche la più alta percentuale distribuzione di C. parapsilosis, 15 isolati su 27 (55.5%) che sopravanza nettamente C. albicans. Tale preoccupante dato è sicuramente correlabile al posizionamento a tutti i neonati di CVC per la nutrizione parenterale e per la terapia, fattore predisponente per l’insorgenza di micosi sistemiche. Preoccupante il trend di isolamento che vede 3 casi di emocoltura positiva per C. parapsilosis nel 2005 e 12 casi nel 2006.

I dati relativi alla sensibilità delle varie specie di funghi isolati, rispetto alle molecole antifungine in uso nel nostro Ospedale, fanno rilevare che il fungo più frequentemente isolato, Candida albicans, è comunque anche il più sensibile e dunque facilmente aggredibile dalle terapie. E’ giusto notare però, che almeno il 3% dei ceppi di C. albicans isolati (43 casi su 1436), presentano una ridotta sensibilità o addirittura una resistenza verso le molecole appartenenti alla classe degli Azoli. Questo dato apparentemente esiguo, deve destare allarme e indurre ulteriori osservazioni. La pressione selettiva operata dalle stesse terapie, potrebbe portare se trascurata, alla selezione in ambito nosocomiale di ceppi resistenti agli Azoli. I 299 ceppi di Candida glabrata isolati, presentano invece una forte riduzione di sensibilità verso Fluconazolo (64%) e Itraconazolo (58%) e probabilmente per il

fenomeno della cross resistenza, anche la sensibilità al Voriconazolo, subisce una lieve flessione (97%). Candida krusei invece, fenotipicamente resistente agli Azoli, presenta solo il 5% dei 65 isolati sensibili al Fluconazolo e il 35% all’Itraconazolo, ma fortunatamente il 100% degli isolati restano sensibili al Voriconazolo. Purtroppo C. krusei presenta anche una forte riduzione di sensibilità 80% verso 5 Fluorocitosina nei ceppi isolati da tutti i materiali biologici e addirittura si scende al 50% per quelli isolati in emocoltura. La riduzione del ventaglio terapeutico dovuto all’insorgere delle resistenze, deve allarmare il Microbiologo, ma soprattutto il Clinico. I dati emersi da questo studio, per quanto parziali e relativi ad un periodo relativamente breve, potrebbero fornire una sorta di cartina tornasole, un piccolo ausilio, nella valutazione per l’implementazione delle terapie antimicotiche da porre in essere nel nostro Ospedale.

In conclusione, il lavoro condotto negli anni 2005-2006, si inserisce coerentemente nei più ampi studi epidemiologici e fotografa con precisione, alcuni dettagli relativi al nostro Ospedale. Se Candida albicans è ancora la specie più frequentemente isolata, specie emergenti come Candida glabrata e Candida krusei assumono particolare rilevanza per la loro resistenza fenotipica ai farmaci antifungini. Tale prerogativa tende a rendere inefficaci i trattamenti terapeutici con un enorme aggravio in termini di morbilità e mortalità. Una particolare attenzione dovrebbe essere rivolta ai i pazienti portatori di dispositivi bio-protesici. Candida parapsilosis, data la sua capacità di produrre biofilm si sta ritagliando un ecosistema per lei privilegiato, ma che enorme danno procura ai pazienti. Purtroppo l’utilizzo dei CVC, crea una condizione predisponente alla colonizzazione da parte dei miceti. Purtroppo l’evoluzione di una colonizzazione, ad infezione focalizzata e talvolta ad infezione disseminata e sepsi da miceti, incrementano notevolmente il numero di giorni di ricovero e il costo delle terapia e delle procedure assistenziali poste in essere. E’ dunque fondamentale per il clinico attingere con razionalità e costanza ai dati che giornalmente emergono dall’attività dell’indagine microbiologica, al fine di preservare nel migliore dei modi l’integrità dei pazienti.

LETTERATURA