valutazione dell’attività procoagulante del TF
4.4 Analisi dell’attività di TF su cellule adese
L’andamento dell’attività di TF osservato nel controllo degli esperimenti descritti potrebbe essere spiegato da un’inibizione dell’espressione di TF legato all’aumento della densità cellulare.
Per verificare questa ipotesi si sono seminate cellule A375 in micro-piastra da 96 pozzetti a densità crescenti a partire 5000 fino a 80.000 cellule, condizione nella quale le cellule sono confluenti (tabella 8). Dopo 24 ore di coltura si è quantificata l’attività di TF mantenendo le condizioni già descritte, a questo scopo le cellule sono state incubate con 25µl di tripsina per 3 minuti a 37°C, quindi si sono immediatamente aggiunti 75µl di PBS e 100µl di pool di plasma. Al termine dei successivi 3 minuti di incubazione a 37°C, si sono aggiunti 50 µl di CaCl2 83,3mM per l’attivazione della reazione di coagulazione.
L’analisi di questi dati mostra la riduzione dell’attività di TF in maniera inversamente proporzionale all’aumento della densità cellulare per le quantità comprese fra 5000 e 40.000 cellule, raggiungendo il plateau a 80.000 cellule.
Quindi questi risultati sono a favore dell’ipotesi che l’aumento della densità cellulare possa influire sul mascheramento della funzione procoagulante del TF.
Figura 4.11: Attività di TF (mU), misurata in cellule adese, in funzione del numero di cellule. Retta di regressione calcolata fra 5000 e 40.000 cellule; il punto indicato in rosso non è stato considerato nella valutazione della retta in quanto non presenta differenze dal punto precedente (raggiungimento del plateau).
Utilizzando lo stesso schema di semina delle cellule in micropiastra appena descritto, si è provato a quantificare l’attività del TF sulle cellule lasciandole adese al fondo dei pozzetti. In questo caso non si riscontrano più le differenze di attività di TF tra le varie densità cellulari e in tutti i casi si osservano valori di attività di TF al limite della sensibilità del metodo.
Questi dati rafforzano l’ipotesi che l’attivazione delle molecole di adesione, in particolare delle integrine, possa influire negativamente sulla funzionalità procoagulante del TF in accordo con quanto riportato in letteratura63, argomento trattato nel paragrafo 1.2.2 del
capitolo introduttivo.
Capitolo 5 : Conclusioni
Nel presente progetto di tesi è stato messo a punto un test funzionale di tipo coagulativo volto a valutare l’attività procoagulante del TF espresso su linee cellulari di origine neoplastica. Lo studio delle condizioni di esecuzione di questo test ha permesso di ottenere un saggio riproducibile e sufficientemente sensibile per poter quantificare l’attività del TF nelle cellule integre, mantenendo perciò inalterato il contesto fosfolipidico nel quale è inserito il TF, elemento fondamentale nella regolazione dell’attivazione del fattore stesso.
Il confronto dei dati di attività di TF ottenuti in questo studio sulle stesse cellule integre o lisate mi permette di proporre che le due condizioni sperimentali forniscono due informazioni diverse e complementari: l’analisi delle cellule in sospensione mostrerebbe la quota di TF funzionale dal punto di vista procoagulante presente sulla superficie cellulare, mentre l’attività di TF determinata sulle cellule lisate indicherebbe il potenziale procoagulante totale delle cellule. Con l’ausilio del test per la quantificazione dell’attività procoagulante del TF è stato possibile studiare l’effetto, sui livelli di attività del TF, di due farmaci comunemente somministrati a pazienti affetti da melanoma con mutazione B-RafV600E, ovvero il
Dabrafenib e il Trametinb, inibitori rispettivamente dell’attività chinasica di B-
RafV600E e MEK. Lo studio è stato condotto sulla linea cellulare di melanoma A375
portatrice della suddetta mutazione.
I risultati ottenuti suggeriscono che i due farmaci siano effettivamente in grado di determinare una diminuzione dell’espressione del TF, effetto maggiormente evidente dopo 48 ore di trattamento. Questa osservazione potrebbe assumere una certa rilevanza clinica nell’ambito del controllo di eventi pro-trombotici associati a patologie cancerose. Tuttavia, almeno in questo modello sperimentale, l’effetto inibitorio sull’attività di TF è risultato confinato ad una finestra temporale molto ristretta, osservazione che potrebbe essere influenzata dall’emivita dei farmaci stessi, dato non disponibile pubblicamente, quanto meno per le due molecole in vitro. I dati di farmacocinetica in vivo disponibili nel data base Drug Bank
Dabrafenib e 4 giorni per Trametinib, inoltre la clearance di entrambi i farmaci è influenzata dal legame con le proteine plasmatiche perciò non è possibile traslare questi dati al contesto dello studio in vitro. Per approfondire questo aspetto sarà necessario ripetere l’esperimento prevedendo l’aggiunta di un’aliquota dei farmaci ogni 24h per cercare di mantenere costante la concentrazione nel tempo. Questa nuova condizione sperimentale dovrà essere accompagnata anche da un nuovo studio della IC50 per queste due molecole, inoltre sarà opportuno condurre in
parallelo una valutazione dell’effetto proapototico indotto dal Trametinib e dal Dabrafenib.
In questo modello è interessante osservare anche l’asincronia tra la riduzione del mRNA per il TF, evidente 24h dopo l’aggiunta dei farmaci, e la diminuzione dell’attività procoagulante di TF, visibile invece 48h dopo l’inizio del trattamento. Questo dato suggerisce che l’mRNA per il TF sia particolarmente stabile, purtroppo non è stato possibile trovare dati in letteratura a sostegno o diniego di questa ipotesi.
I dati raccolti in questo progetto di tesi hanno soprattutto messo in luce una complessità inaspettata della regolazione dell’espressione e attivazione del fattore tissutale. Infatti possiamo ipotizzare un importante coinvolgimento delle proteine di adesione, caderine e integrine, sulla regolazione del TF. La modulazione avverrebbe a due livelli diversi: uno di regolazione dell’espressione genica del TF dipendente dall’attivazione delle caderine, infatti l’attività del TF diminuisce all’aumentare della densità cellulare. Il secondo livello di regolazione agirebbe invece sulla proteina TF presente in membrana, rendendola funzionalmente inattiva, fenomeno che dipenderebbe in questo caso dall’attivazione delle integrine. Potrebbe essere interessante confrontare gli effetti sul TF del modello di crescita in monostrato o in sospensione in forma di sferoide.
Le linee cellulari di melanoma, naturalmente, costituisco un modello in vitro di crescita in adesione, perciò la modulazione sia dell’espressione che della conformazione del TF da parte delle molecole di adesione rende questo modello
particolarmente complicato da interpretare e propone un’ulteriore riflessione sulle condizioni sperimentali di valutazione dell’attività di TF nei modelli cellulari: - La quantificazione dell’attività di TF su cellule adese potrebbe rappresentare il potenziale procoagulante delle cellule quando adese alla massa tumorale - La misura dell’attività di TF sulla sospensione cellulare potrebbe indicare il potenziale procoagulante delle cellule tumorali circolanti che non hanno più impegnate le caderine e le integrine
- L’attività di TF sul lisato cellulare potrebbe rappresentare il potenziale procoagulante totale delle cellule che potrebbe esprimersi in seguito a fenomeni di apoptosi con rilascio di corpi apoptotici
La sensibilità del test funzionale messo a punto in questa tesi è anche tale da poter misurare l’attività di TF rilasciata nel terreno di coltura, tuttavia le condizioni di preparazione del campione non permettono di distinguere se il TF sia rilasciato su microparticelle o su corpi apoptotici. Sulla base dell’andamento della crescita cellulare dedotto dalla quantificazione proteica è molto probabile che nelle prime 24h dall’inizio del trattamento le cellule siano andate in apoptosi, il fatto che nel terreno sia rivelabile l’attività di TF fa supporre che il processo di apoptosi non induca la degradazione del TF, la cui attività anzi potrebbe essere aumentata proprio dall’esposizione della fosfatilserina, fenomeno tipicamente associato al processo di apoptosi.
In conclusione, lo studio del potenziale procoagulante TF-dipendente in modelli cellulari tumorali deve prendere in considerazione gli aspetti molecolari di regolazione dell’espressione genica del TF, gli aspetti biochimici descrittivi della quota funzionalmente attiva di TF ed infine, sarebbe corretto valutare nello specifico modello l’influenza delle molecole di adesione.