Colture cellular

I materiali utilizzati per le colture cellulari, se non diversamente indicato, sono forniti dalla ditta Sigma-Aldrich.

3.1.1 Linea cellulare

La linea cellulare utilizzata, acquistata dalla ditta “American Type Culture Collection” (ATTC, Manassas VA), è la linea di melanoma umano maligno A-375 portatrice della mutazione B-Raf V600E_.

3.1.2 Condizioni di coltura

Le cellule sono state mantenute in incubatore a 37°C, in atmosfera satura di umidità e con CO2 al 5%.

Il terreno di coltura utilizzato, il Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), contiene L-glutammina (4mM), 4500 mg/L di glucosio, 1mM di sodio piruvato e 15000 mg/L di sodio bicarbonato ed è stato integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato al calore (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina.

3.1.3 Condizioni di trattamento delle cellule A375

Dopo 24 ore di crescita in piastra con terreno completo, questo viene sostituito con lo stesso terreno al quale si aggiugne il farmaco Trametinib, alla concentrazione finale di 0,1 nM, o il farmaco Dabrafenib alla concentrazione finale 1 nM. Nelle piastre destinate al controllo viene aggiunto dimetilsolfossido (DMSO) diluito 1:1000 in terreno. La preparazione delle soluzioni madri dei farmaci è descritta successivamente

Le cellule destinate alla valutazione dell’espressione dell’mRNA del TF sono state seminate in piastre con 6 pozzetti da 6 cm2 _{in 2 ml di terreno, mentre quelle destinate}

all’analisi dell’attività del TF tramite il test di coagulazione, alla quantificazione proteica e al Western Blot, sono state seminate in piastre da 10 cm2 _{con 10 ml di terreno.}

Si è deciso di piastrare, sia per le piastre da 10 cm2 _{che per quelle da 6 cm}2_{, 1.400.000}

cellule per piastra. Questa scelta si è basata su una serie di prove che ha portato a individuare questo numero di cellule come quello necessario per far si che arrivino a confluenza alle 72 ore, condizione ottimale per effettuare i trattamenti nell’arco di una settimana.

3.1.3.1 Semina in piastra

Per avere un numero di cellule e di terreno sufficienti ad eseguire il test di coagulazione, la quantificazione proteica e il Western Blot ad ogni stadio di valutazione (t0, 24, 48 e 72

ore) si sono piastrate 22 piastre da 10 cm2_{, così come mostrato in figura 3.1.}

Il to indica le cellule che sono state raccolte dopo 24 ore di crescita in terreno completo,

prima dell’esecuzione dei trattamenti.

Figura 3.1: schema piastratura per le cellule destinate al test di coagulazione, alla quantificazione proteica e al Western Blot. C=controllo, T=Trametinib, D=Dabrafenib.

Per effettuare la valutazione delle cellule al tempo to è stato necessario seminare 4 piastre

per poter raggiungere un numero di cellule sufficienti ad eseguire tutti i test previsti. Dalle 24 ore in poi il numero di cellule in coltura sarebbe stato sufficientemente elevato da

permettere la semina semplicemente in singolo ma è stata comunque necessaria la piastratura in doppio per ottenere i 20 ml di terreno necessari per la determinazione dell’attività del TF rilasciata nel terreno, così come descritto in dettaglio successivamente in questo capitolo.

La semina in piastra per le cellule destinate alla valutazione dell’mRNA del TF è stata invece eseguita in singolo ed esemplificata nella figura 3.2. La quantificazione dell’mRNA per il TF è stata ottenuta anche dopo solo 4 e 8 ore dall’esecuzione del trattamento.

Figura 3.2: schema piastratura per le cellule destinate all’analisi dell’mRNA. C=controllo, T=Trametinib, D=Dabrafenib

3.1.3.2 Preparazione dei farmaci

Per entrambi i farmaci, Trametinib (cod:GSK1120212) e Dabrafenib (cod:GSK2118436), si ha a disposizione una soluzione 10 mM in DMSO, quindi per ottenere le soluzioni di utilizzo sono state effettuate delle diluizioni intermedie in DMSO.

Per il Trametinib si è seguito il seguente schema:

1° diluizione: 1:100 à 3 µl della soluzione madre del farmaco in 300 µl di DMSO 2° diluizione: 1:100 à 3 µl della prima diluizione in 300 µl di DMSO

3° diluizione: 1:10 à 10 µl della seconda diluizione in 100 µl di DMSO

Si è così giunti a una soluzione concentrata 0,1 µM. A questo punto, per ottenere la concentrazione d’uso di 0,1 nM è stato sufficiente effettuare un’ultima diluizione 1:1000 nel terreno completo di coltura.

Per il Dabrafenib si è eseguito il seguente schema:

1° diluizione: 1:100 à 3 µl della soluzione madre del farmaco in 300 µl di DMSO 2° diluizione: 1:100 à 3 µl della prima diluizione in 300 µl di DMSO

Si è così ottenuta una soluzione concentrata 1 µM. Anche in questo caso per raggiungere la concentrazione d’uso finale (1 nM), si è effettuata un’ultima diluizione 1:1000 in terreno.

Il terreno contenente i farmaci e quello di controllo contenente il DMSO è stato inserito nelle piastre di coltura dopo 24 ore di crescita cellulare in terreno completo.

3.1.4 Raccolta delle cellule

Dopo 24, 48 e 72 ore dall’aggiunta dei farmaci, le cellule destinate alla valutazione dell’attività del TF, alla quantificazione proteica e al Western Blot sono state staccate dalla plastica con 1 ml di soluzione di tripsina 5 g/l ed EDTA sodico 0,2 g/l incubandole 3 minuti a 37°C.

Quindi le cellule destinate al Western Blot, dopo aver subito una centrifugazione a 0,2 g per 5 minuti, un lavaggio in tampone fosfato salino di Dulbecco (PBS) e una seconda centrifugazione uguale alla prima, sono risospese in un volume minimo di PBS (200/500 µl) e conservate a -80°C.

Le cellule destinate alla valutazione dell’attività del TF invece sono risospese in un volume di PBS adeguato a far si che in 100 µl di soluzione siano contenute 300.000 cellule, numero di cellule necessario per l’esecuzione del test. Il conteggio delle cellule viene eseguito con l’ausilio di una camera di Burker; per fare ciò, un’aliquota di cellule tripsinizzate e risospese nel proprio terreno completo, viene diluita 1:2 con Tripan Blue e inserita nella camera per il conteggio.

Per quanto riguarda le cellule destinate alla valutazione dell’mRNA, dopo essere state staccate dalla plastica con 200 µl della stessa soluzione di tripsina sopra citata sono risospese in 800 µl del proprio terreno di coltura. Le eppendorf contenenti la sospensione cellulare subiscono quindi una centrifugazione di 5 minuti a 1000 g, le cellule raccolte nel pellet sono quindi risospese in 1 ml di PBS e nuovamente sottoposte ad una seconda centrifugazione uguale alla prima. A questo punto il sopranatante viene aspirato e il pellet conservato a -80°C.