valutazione dell’attività procoagulante del TF
4.2 Valutazione dell’espressione e dell’attività del TF in cellule A
Il test coagulativo appena descritto è stato utilizzato per la valutazione dell’attività procoagulante del TF nella linea cellulare di melanoma A375, 24, 48 e 72 ore successive al trattamento con i due farmaci “Trametinib” e “Dabrafenib”, inibitori rispettivamente di MEK e B-Raf, proteine implicate anche nella via di espressione del TF.
In questo studio sono state utilizzate le concentrazioni 0,1 nm e 1 nm rispettivamente per
i farmaci Trametinib e Dabrafenib in quanto inferiori alle IC50 determinate
sperimentalmente presso la Fondazione Pisana Per La Scienza ONLUS (IC50 Trametinib
1nM, IC50 Dabrafenib 10nM).
4.2.1 Valutazione della crescita cellulare
Per valutare la crescita cellulare si è determinata la quantità totale delle proteine presenti in piastra a tutti i tempi sperimentali. Si è osservato un costante aumento della proteina per il controllo, mentre per i due trattamenti si è riscontrata una iniziale riduzione della proliferazione cellulare del controllo alle 24 ore seguito da un recupero della proliferazione.
Figura 4.5. Proteine presenti nella piastra di Controllo (C), in quella trattata con Trametinib (T) e in
quella trattata con Dabrafenib (D), a tutti i tempi sperimentali (24, 48, 72 h).
* p<0,05 T48 e D48 vs C48; # p<0,05 T48 vs C48 e D48
4.2.2 Valutazione dell’espressione dell’RNA messaggero per TF
L’analisi dell’espressione dell’RNA effettuata 4, 8, 24, 48, 72 ore dopo i trattamenti con i farmaci, ha fornito i risultati mostrati nella figura 4.6 sottostante.
Figura 4.6: Andamento temporale dell'espressione dell'mRNA nei due trattamenti e nel controllo. C=controllo; D=Drabafenib; T=Trametinib. Statistica: C vs D 48h p=0,0463; C vs D 72h p=0,029
L’analisi Real Time PCR mostra una riduzione del mRNA del TF alle 48 h come dimostrato per l’attività e inoltre questi dati indicano che la riduzione dell’attività del TF osservata anche nelle cellule di controllo dipende da una inibizione dell’espressione dell’mRNA confermando l’esistenza di meccanismi di regolazione della produzione di TF verosimilmente dipendenti dalla densità cellulare.
4.2.3 Analisi dell’attività del TF presente sulla superficie cellulare
L’attività di TF è stata valutata su cellule integre portate in sospensione (300000 cellule/100µl) oppure dopo lisi per congelamento e scongelamento della suddetta sospensione. I risultati ottenuti in tc (secondi) sono stati convertiti in attività di TF e
corretti per la quantità di proteina totale (tabella 6).
C4 D4 T4 C8 D8 T8 C2 4 D2 4 T2 4 C4 8 D4 8 T4 8 C7 2 D7 2 T7 2 RN A T 0 0 1 2 3 T F R e la ti v e N o r m a li z e d E x p r e s s io n
Tabella 6. Attività specifica di TF (U/mg proteina) misurata nelle 2 differenti condizioni sperimentali (sospensione e congelato-scongelato) e nel terreno di coltura 24, 48, 72 h dopo il trattamento con i due farmaci.
C
T
D
Sospensione t0 10,60 ± 0,14 24h 4,47 ± 0 ,62 4,62 ± 0,55 6,18 ± 0,06 48h 4,92 ± 0,16 2,11 ± 0,21 2,60 ± 0,19 72h 1,10 ±0,17 1,87 ± 0,19 1,36 ± 0,09 Congelato -Scongelato t0 68,64 ± 12,51 24h 54,99 ± 5,34 59,66 ± 13,86 90,74 ± 17,68 48h 27,10 ± 7,11 11,02 ± 0,89 5,86 ± 0,39 72h 6,16 ± 0,51 1,80 ± 0,27 3,72 ± 0,21 Terreno t0 0,243 ± 0,004 24h 0,035 ± 0,0080,130 ± 0,004 0,068 ± 0,040 48h 0,026 ± 0,003 0,028 ± 0,006
0,034 ± 0,011 72h 0,019 ± 0,007 0,015 ± 0,003 0,021 ± 0,003 C= Controllo, T=Trametinib, D=Dabrafenib
I dati sono riportati come valore medio ± deviazione standard. L’attività di TF nel terreno di coltura è stata normalizzata sul contenuto di proteina nella piastra.
I dati riportati in tabella 6 mostrano un’evidente differenza nei valori di attività di TF misurati nelle due diverse condizioni sperimentali testate, poiché, come precedentemente detto, la perturbazione dell’asimmetria di membrana a seguito della lisi per congelamento e scongelamento attiva il TF presente in forma silente. È chiaro quindi che le cellule congelate/scongelate abbiano valori di attività di TF generalmente maggiori rispetto a quelli misurati nelle cellule in sospensione.
L’analisi delle cellule in sospensione mostrerebbe quindi la quota di TF esposto sulla superficie cellulare che si trova in forma attiva dal punto di vista procoagulante, mentre
l’attività determinata sulle cellule lisate rappresenterebbe il potenziale procoagulante totale delle cellule.
I dati riportati in tabella 6, riguardanti la sospensione cellulare, sono stati rappresentati graficamente in figura 4.7.
Figura 4.7. Rappresentazione grafica dell’andamento dell’attività del TF misurata nella sospensione
cellulare a tutti i tempi di osservazione. C= controllo, T=Trametinib, D=Dabrafenib *p < 0,05 rispetto al C48; § p < 0,05 rispetto a t0, C24 e C48
L’analisi dei dati dimostra che il Trametinib e il Dabrafenib sono entrambi in grado di inibire il TF espresso sulla membrana cellulare, ma il fenomeno è evidente solo dopo 48 ore di trattamento e rimane stabile nelle 24 ore successive (72h). Questo risultato è evidente sia sulla sospensione cellulare e ancor meglio sul lisato cellulare (figura 4.6) anche se in quest’ultimo caso i valori di attività sono molto maggiori (circa un fattore 10 rispetto alla sospensione).
L’esperimento mette in evidenza anche un comportamento particolare di queste cellule: si osserva, all’aumentare del tempo di coltura, una diminuzione dell’attività del TF anche nel controllo stesso che a 72 ore raggiunge i livelli indotti dal trattamento farmacologico.
È possibile quindi che si stiano in realtà osservando due fenomeni: uno dovuto al farmaco e uno relativo alla densità cellulare che potrebbe influire negativamente sull’espressione del TF.
Figura 4.8. Rappresentazione grafica dell’andamento dell’attività del TF misurata nel lisato cellulare a tutti i tempi di osservazione. C= controllo, T=Trametinib, D=Dabrafenib
*p < 0,05 rispetto a C48; § p < 0,05 rispetto a t0, C24 e C48
4.2.4 Analisi dell’attività del TF rilasciata nel terreno di coltura
Per quanto riguarda l’analisi dell’attività del TF associato alle microvescicole rilasciate nel terreno di coltura, i risultati ottenuti mostrano un aumento dell’attività specifica di TF, espressa come attività per mg di proteina totale in piastra, in seguito ai trattamenti con Trametinib e Dabrafenib (figura 4.9). L’aumento è particolarmente evidente 24 h dopo l’inizio del trattamento quando è stata riscontrata anche una riduzione della crescita cellulare (figura 4.5). Al tempo successivo (48h) solo le cellule trattate con Dabrafenib presentano un’attività specifica di TF nel terreno significativamente superiore alle cellule di controllo (p<0.05); a 72h invece non si osserva più differenza rispetto al controllo.
Sembra quindi che il marcato aumento di attività di TF associata a microvescicole che si osserva dopo 24 ore di trattamento sia effettivamente conseguente all’applicazione del farmaco. Sulla base dell’andamento delle proteine descritto in figura 4.5 si può ipotizzare che i farmaci abbiano indotto un fenomeno di apoptosi con conseguente rilascio di corpi apoptotici nel terreno di coltura che contribuiscono all’attività di TF presente nel terreno.
Figura 4.9. Rappresentazione grafica dell’andamento dell’attività del TF misurata nel terreno cellulare a tutti i tempi di osservazione. C= controllo, T=Trametinib, D=Dabrafenib
* p < 0,05 T24 vs C24; § p < 0,05 T24 vs T48 e T72; # p < 0,05 D24 vs a D72
4.2.5 Utilizzo di plasma carente di fattore VII o XII per confermare l’attivazione della cascata coagulativa da parte del TF
Per confermare che la reazione di coagulazione osservata fosse effettivamente attivata dal TF presente sulla membrana cellulare, ogni punto sperimentale (sospensione, lisato) è stato ripetuto anche utilizzando 100 µl di plasma carente di fattore VII al posto del normale pool di plasma, così come è stato descritto nel capitolo “Materiali e Metodi” paragrafo 4.2.3. I valori ottenuti da queste prove dimostrano un evidente riduzione dell’attivazione della coagulazione, questo significa che l’attivazione
della cascata della coagulazione osservata in presenza delle cellule A375 dipende effettivamente dal TF.
L’induzione della formazione del coagulo di fibrina nel pool di plasma in vitro potrebbe dipendere anche dall’attivazione del fattore XII da parte di cariche negative esposte sulla membrana plasmatica. Per valutare questo contributo si è ripetuto l’esperimento anche con 100µl di plasma carente di fattore XII ottenendo in questo caso valori simili a quelli ottenuti con il pool di plasma. Questi, riportati in tabella 7, escludono il contributo del fattore XII e rafforzano il ruolo del TF.
Anche nel caso dell’attività procoagulante di TF riscontrata nel terreno si è verificato che dipende esclusivamente dal sistema TF-FVII, escludendo il coinvolgimento del FXII.