3.12.2 Analisi al microscopio a fluorescenza
4.6 Analisi della proliferazione mediante Cyquant
Si è provato, anche, un metodo alternativo di analisi della sintesi del DNA, il saggio Cyquant ®. Esso si basa sulla misurazione della quantità del DNA attraverso il legame di un colorante fluorescente. Anche con quest’analisi non sono state osservate differenze significative tra controlli e trattati (Fig. 23-24).
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77 Figura 23: Analisi proliferazione cellulare mediante test CyQuant in cellule ECV-304
dopo 24 ore trattamento con NPs di TiO2, SiO2 e ZrO2.
Figura 24: Analisi proliferazione cellulare mediante test CyQuant in cellule ECV-304
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4.7 Analisi della risposta apoptotica
Lo studio è proseguito indagando il meccanismo apoptotico quale possibile causa del fenomeno di morte cellulare osservato A tal fine le cellule sono state trattate con NPs non funzionalizzate a differenti concentrazioni per 24 e 48 ore, abbiamo usato come controllo negativo cellule non trattate. Al termine del trattamento, abbiamo utilizzato il kit fluorimetrico Apopercentage (Biocolor) per verificare un possibile coinvolgimento del processo apoptotico. Come si può osservare nelle figure 25-26 e 27, le NPs di TiO2 e SiO2 inducono il fenomeno
apoptotico, con differenze statisticamente significative rispetto ai controlli, alle concentrazioni più alte e con tempi di trattamento
maggiori. Le NPs di ZrO2, invece, non sembrano indurre apoptosi.
Figura 25: Valutazione dell’apoptosi in cellule ECV-304 dopo l’aggiunta di diverse
concentrazioni di NPs di SiO2. I risultati sono espressi come rapporto dei valori di fluorescenza
del trattato sul controllo T/C. * significativamente diverso dal controllo. #, significativamente diverso dal controllo e significativamente diversi tra di loro.
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79 Figura 26: Valutazione dell’apoptosi in cellule ECV-304 dopo trattamento per 24 e 48 ore con
diverse concentrazioni di NPs di TiO2. I risultati sono espressi come rapporto dei valori di
fluorescenza del trattato sul controllo T/C. * significativamente diverso dal controllo. #, significativamente diverso dal controllo e significativamente diversi tra di loro.
Figura 27: Valutazione dell’apoptosi in cellule ECV-304 dopo trattamento per 24 e 48 ore con
diverse concentrazioni di NPs di ZrO2. I risultati sono espressi come rapporto dei valori di
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4.8 Valutazione del coinvolgimento del Citocromo C nel
danno cellulare indotto dalle nanoparticelle
Per confermare un’induzione dell’apoptosi, come uno dei possibili meccanismi alla base della riduzione della vitalità cellulare nelle cellule
trattate con le NPs di SiO2, abbiamo voluto determinare la localizzazione
intracellulare del citocromo C dopo trattamento. Il citocromo C è normalmente localizzato nella membrana interna dei mitocondri. Esso è un componente essenziale della catena di trasporto degli elettroni, ma è anche un intermedio nel processo di apoptosi. Il citocromo C viene, infatti, rilasciato nel citosol in risposta agli stimoli pro-apoptotici. Nel citoplasma, il citocromo C si lega ad Apaf1 e ATP generando un complesso proteico detto apoptosoma, che aggrega procaspasi 9 attivandole e inducendo apoptosi (22).
Nei nostri esperimenti, le ECV-304 sono state piastrate su vetrini e dopo 24 ore trattate per 8 ore con le NPs in esame. Successivamente, le cellule sono state marcate con una sonda specifica per i mitocondri e seguendo il protocollo per l’immunofluorescenza descritto in materiali e metodi sono state incubate con un anticorpo specifico per il citocromo C per 1 ora a temperatura ambiente e successivamente con anticorpo secondario anti-mouse coniugato con la FITC per un’altra ora. Dopo colorazione dei nuclei con Hoechst 33342, i vetrini sono stati osservati al microscopio a fluorescenza (fig.28-29). Per ogni campione, le cellule con un aumento di fluorescenza verde sono state contate (minimo 5 campi). I risultati, espressi come numero di cellule positive per la fluorescenza verde per campo (media ± SD), sono riportati nella fig 28 a.
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81 Figura 28: Immagini rappresentative ottenute al microscopio a fluorescenza delle
ECV-304 trattate (immagine b) e non trattate (immagine a) con NPs di SiO2
(100 g/ml). La colorazione blu rappresenta i nuclei, la rossa i mitocondri e la verde il citocromo C.
Figura 29a: Numero di cellule positive per il JC-1 verde per campo (media ±SD di 5
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82 Figura 29: Immagini rappresentative ottenute al microscopio a fluorescenza delle
ECV-304 trattate (immagine b) e non (immagine a) con NPs di SiO2. Dalle foto si può
apprezzare la disposizione del citocromo C (fluorescenza verde) all’interno delle cellule.
Come si può osservare in figura 28 il citocromo C mostra una differente disposizione intracellulare nelle cellule trattate rispetto alle cellule non trattate (CTRL). In queste ultime, infatti, il citocromo C è localizzato prevalentemente all’interno dei mitocondri (figura 28, immagine a.), la colorazione rossa, rappresentante i mitocondri, è sovrapposta alla colorazione verde, rappresentante il citocromo C, evidenziando cosi un colore giallo. Nelle cellule trattate, invece, il citocromo C è distribuito nel citoplasma (figura 28, immagine b). Ciò è dovuto alla perdita del
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83 colorante rosso (MitoTracker Red) da parte dei mitocondri danneggiati e alla contemporanea fuoriuscita nel citosol del citocromo C (verde). Il grafico nella figura 28b, descrive in maniera quantitativa il fenomeno osservato al microscopio a fluorescenza. Nella figura 29, le foto sono state fatte a maggior ingrandimento (100 X) in modo da osservare meglio la distribuzione del citocromo C. Come si può osservare nelle immagini, nei controlli la fluorescenza verde ha un aspetto puntiforme, mentre nei trattati ha una distribuzione più diffusa.
4.9 Valutazione della fluorescenza associata alle cellule
dopo trattamento
In che modo le NPs pottrebbero scatenare il fenomeno apoptotico o la morte cellulare in generale? Questa è la domanda che ci siamo posti. Abbiamo ipotizzando un potenziale uptake delle NPs da parte delle cellule quale meccanismo scatenante il danno osservato. Abbiamo quindi voluto quantificare la fluorescenza associata alle cellule dopo trattamento con le NPs funzionalizzate per valutare un potenziale up- take cellulare. La quantificazione è stata fatta sia con osservazione al
microscopio a fluorescenza (per le NPs di SiO2) che con analisi
fluorimetrica (per tutte e tre le NPs in esame). Per l’analisi al microscopio a fluorescenza, abbiamo trattato le cellule ECV-304 con le
diverse concentrazioni (1-10-50 e 100 g/ml) di NPs di SiO2 per 12 ore
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84 controlli cellule non trattate. Di seguito, sono riportate le immagini ottenute al microscopio a fluorescenza delle cellule trattate con SiO2
(fig.30).
Per ogni campione le cellule con un aumento di fluorescenza verde sono state contate (minimo 5 campi). I risultati sono espressi come numero di cellule positive per la fluorescenza verde per campo (media ± SD) (fig. 30a).
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85 Figura 30: Immagini rappresentative ottenute al microscopio a fluorescenza delle
ECV-304 trattate con NPs di SiO2 alle concentrazioni di 1-10-50 e 100 g/ml per 12
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86 Figura 30a: Numero di cellule positive per la FITC per campo (media ±SD di 5
campi esaminati) nei due diversi gruppi (40X).
Dalla figura 30, si può notare un aumento di fluorescenza con l’aumentare della concentrazione della NPs usate per il trattamento. Suggerendo un possibile up-take cellulare dose-dipendente. Il grafico nella figura 30a descrive in maniera quantitativa il fenomeno osservato al microscopio a fluorescenza.
I risultati ottenuti al microscopio a fluorescenza sono stati confermati anche dall’analisi fluorimetrica (Fig 31-32-33) e dall’analisi al TEM (fig.34-35-36).
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Figura 31: Analisi della fluorescenza associata alle cellule ECV-304 dopo trattamento di 1-
6 e 10 ore con le NPs di SiO2 funzionalizzate con la FITC. Le concentrazioni dei trattamenti,
riportati nel grafico, sono relative alle quantità delle NPs nei pozzetti ( g/0,2ml).
Figura 32: Analisi della fluorescenza associata alle cellule ECV-304 dopo trattamento di 1-
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88 Figura 33: Analisi della fluorescenza associata alle cellule ECV-304 dopo trattamento di 1-
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Immagine A
Immagine B
Figura 34: Immagini A e B al TEM delle cellule ECV-304 dopo trattamento con NPs di SiO2
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Immagine C
Immagine D
Figura 35: Immagini C e D al TEM delle cellule ECV-304 dopo trattamento con NPs di ZrO2
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Immagine E
Immagine F
Figura 36: Immagini E ed F al TEM delle cellule ECV-304 dopo trattamento con NPs di TiO2
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Dalle foto ottenute al TEM, si può notare come le NPs di TiO2, SiO2 e
ZrO2, dopo un breve trattamento di un’ora, sono in grado di penetrare
all’interno delle cellule endoteliali attraverso un processo plausibilmente di tipo endocitotico. Nelle immagini, si osservano chiaramente le modificazioni della forma della membrana plasmatica delle ECV-304, che si invagina per formare le vescicole che racchiudono le NPs da introdurre nelle cellule. Le vescicole vengono rilasciate dalla membrana citoplasmatica e convogliate nel citosol. L’analisi al TEM si è dimostrata più sensibile dell’esame fluorimetrico, in quanto in grado di rivelare la penetrazione di piccole quantità di NPs già dopo un ‘ora di trattamento.
Successivamente ci siamo concentrati sulle NPs di SiO2 funzionalizzate
e non con FITC, analizzando gli effetti indotti dalle NPs su diversi parametri cellulari. Ciò allo scopo di individuare i potenziale/i meccanismo/i molecolare/i alla base del danno indotto dalle NPs.