3.12.2 Analisi al microscopio a fluorescenza
4.11 Quantificazione delle specie ossigeno reattive (Ros)
mediante sonda H
2DCF-DA
La disfunzione mitocondriale è associata ad un’aumentata generazione di specie reattive dell’ossigeno (34). Abbiamo voluto quindi verificare la presenza di stress ossidativo nelle cellule, dopo il trattamento con le NPs, quantificando le specie reattive dell’Ossigeno (ROS) mediante una sonda fluorescente. Le ECV-304 sono state trattate
con le diverse concentrazioni di NPs di SiO2 non funzionalizzate con la
FITC, le cellule non trattate (CTRL) sono state usate come controlli. Dai risultati ottenuti, si è notato che le concentrazioni 1 e 10 g/ml non inducono aumento di ROS rispetto ai controlli. Al contrario, il
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96 trattamento delle cellule con concentrazioni di NPs maggiori (50 e 100 g/ml) ha indotto un aumento statisticamente significativo dei livelli intracellulari dei ROS rispetto alle cellule non trattate (fig.40).
Abbiamo voluto verificare una possibile interferenza delle NPs di SiO2
con la sonda DCF utilizzata per la quantificazione dei ROS, ripetendo l’esperimento precedente su una piastra nera in assenza di cellule. Come è possibile notare dal grafico, non si ha nessuna interferenza delle NPs con la sonda (Fig.40).
Figura 40: Misura dei ROS con H2DCF-DA in ECV-304 dopo trattamento con le NPs
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4.12 Selezione cloni stabili Ecv 304-roGFP e Ecv 304-MTX
roGFP
Nel nostro lavoro, lo stress ossidativo è stato investigato anche utilizzando le ECV-304-roGFP e ECV-304-MTX-roGFP. Questo metodo consente di valutare lo stato redox cellulare in maniera non invasiva e in tempo reale. La roGFP viene costruita a partire dalla proteina fluorescente verde GFP, il cui gene codificante è stato isolato dal DNA della medusa Aequorea victoria, nel 1994 (9).
La GFP è una proteina di 238 amminoacidi (26 KDa). La sua struttura tridimensionale è costituita da 11 foglietti beta che costituiscono un β barrel. Sono poi presenti due alfa eliche, una lungo l’asse centrale del cilindro che contiene il cromoforo e una alla base (74).
La GFP è spesso usata come indicatore passivo di espressione genica o localizzazione proteica. Tuttavia sono state costruite della varianti che fungono da indicatori della concentrazione intracellulare di ioni H+ o
Ca2+. Inoltre è possibile creare varianti di GFP per specifici organelli, in
questo modo si è in grado di monitorare aree specifiche all’ interno delle singole cellule per un determinato periodo di tempo (23).
La redox sensitive GFP (roGFP) viene costruita introducendo mutazioni nella GFP per sostituzione di particolari amminoacidi vicini al cromoforo, in modo tale che modificazione del loro stato di ossidazione determini modificazioni della fluorescenza della proteina. La roGFP presenta due picchi massimi di eccitazione a circa 400 e 490 nm e mostra dei cambiamenti reversibili della fluorescenza in risposta a modificazioni dello stato redox cellulare sia in vivo che in vitro. La
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98 roGFP2 è stata ottenuta sostituendo la serina 147 e la glutammica 204 con due cisteine, in grado di formare reversibilmente un ponte disolfuro in ambiente ossidante. La formazione del ponte disolfuro determina dei cambiamenti geometrici nella proteina che si propagano fino alla regione del cromoforo, determinando il cambiamento redox-dipendente nello spettro di eccitazione (23). La roGFP2 agisce selettivamente con la glutaredossina, un enzima che appartiene alla classe delle ossido- reduttasi che utilizza il glutatione come cofattore. Pertanto, la roGFP2 è in grado di monitorare lo stato redox del glutatione, uno dei più importanti antiossidanti che l’organismo può produrre (42). Il glutatione può comportarsi anche come pro-ossidate nella sua forma ossidata (GSSG). La forma ossidata del glutatione (GSSG) viene convertita nella forma ridotta grazie all’azione della glutatione reduttasi, che usa NADPH come agente riducente. L’omeostasi del rapporto GSH/GSSG è fondamentale nella cellula per assicurare un ottimale equilibrio redox. Variazioni dell’equilibrio redox si riflettono anche in cambiamenti del rapporto GSH/GSSG. In condizioni normali la coppia redox del glutatione è presente con la forma ridotta GSH predominante rispetto alla ossidata. Tuttavia, in presenza di stress ossidativo, l’equilibrio viene spostato a favore della forma ossidata, che si può legare alle proteine e glutationarle (53).
Nel nostro lavoro abbiamo utilizzato una roGFP2 ad espressione prevalentemente citosolica e un’altra forma ad espressione prevalentemente mitocondriale grazie all’inserzione nel vettore di espressione di una sequenza segnale per il mitocondrio.
Le ECV-304 sono state stata utilizzata per creare due linee cellulari esprimenti in modo stabile e costitutivo le due varianti della roGFP
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99 sensibile allo stress ossidativo (roGFP, citosolica - MTX-roGFP, mitocondriale).
Per far questo sono state trasfettate le ECV-304 con i due plasmidi utilizzando come reagente la lipofectammina 2000 (Invitrogen) seguendo le istruzioni della ditta. Dopo 48h dalla trasfezione è stata effettuata la selezione dei cloni aggiungendo nel terreno di coltura l’antibiotico G418 (Geneticina) alla concentrazione di 0,8 mg/ml per circa tre settimane.
I cloni relativi a ciascun costrutto sono stati prelevati, cresciuti per 2-4 passaggi ed analizzati al microscopio a fluorescenza (Olympus X170). Qui di seguito sono riportate le foto ottenute al microscopio (Fig. 41).
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100 Come si può notare dalle foto la fluorescenza nelle ECV-MTX roGFP è localizzata a livello dei mitocondri. Tutte le cellule possiedono la fluorescenza verde, confermando la buona riuscita della selezione dei cloni. Nelle ECV-roGFP, invece, la fluorescenza è distribuita in tutto il citoplasma. Alcune cellule risultano essere prive di fluorescenza, pertanto i cloni ottenuti non risultano puri.
4.13 Determinazione dello stato redox delle ECV-304-
roGFP e ECV-304-MTXroGFP dopo trattamento con le
nanoparticelle
Le ECV-304-roGFP e ECV-304-MTXroGFP sono state seminate in piastre da 24 pozzetti (Greiner) e trattate per tempi diversi con NPs di
SiO2 non funzionalizzate con la FITC alla concentrazione di 100 g/ml.
Sono stati usati come controlli cellule non trattate e cellule trattate con
H2O2 e DTT (2 mM) 1h prima della fine del tempo sperimentale.
Appropriate concentrazioni di H2O2 determinano la completa
ossidazione della roGFP, mentre la completa riduzione della proteina è determinata da appropriate concentrazioni di DTT (58). Al termine del tempo sperimentale, la fluorescenza è stata misurata con un lettore di piastre per fluorescenza GENios plus (Tecan)
,
utilizzando i filtri di eccitazione a 400 e 485 nm e di emissione a 535 nm. Come si puòosservare nel grafico (Fig. 42), le cellule ECV-304-MTXroGFP trattate
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101 differenza statisticamente significativa rispetto alle cellule non trattate in tutti i tempi sperimentali esaminati, fatta eccezione dei tempi intermedi (6 e 10 ore di trattamento). Le cellule trattate con NPs di SiO2 hanno
riportano un aumento dello stato ossidativo dopo 2, 24 e 48 ore di trattamento con una differenza statisticamente significativa rispetto alle cellule non trattate. Mentre dopo 1, 6 e 10 ore di trattamento non si osserva una differenza statisticamente significativa con le cellule trattate con H2O2 e con le cellule non trattate. Nel grafico 43, sono riportati i
risultati ottenuti trattando le ECV-304-Ro-GFP con le NPs di SiO2.
Come si può osservare, le cellule trattate con H2O2 hanno riportato un
aumento dello stato ossidativo in tutti i tempi sperimentali con una differenza statisticamente significativa rispetto ai controlli. Le cellule trattate, invece, hanno riportato un aumento statisticamente significativo dello stato ossidativo dopo 1, 2 e 10 ore di trattamento. In quest’ultimo punto sperimentale, si è osservato un aumento dello stato ossidativo maggiore rispetto alle cellule trattate con H2O2.
I risultati con le due roGFP confermano i dati ottenuti con la sonda
H2DCF-DA, evidenziando inoltre che le NPs sono in grado di alterare in
maniera significativa lo stato redox intra-mitocondriale. Questo suggerisce i mitocondri danneggiati dalle NPs quale possibile fonte di ROS intracellulari.
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102 Figura 42: Analisi dello stato redox delle cellule ECV-304-MTXroGFP dopo trattamento di 1 ora con H2O2, usata come controllo positivo, e NPs di SiO2 (100 g/ml) per diversi tempi.
* significativamente diverso dal controllo
Figura 43: Analisi dello stato redox delle cellule ECV-304-roGFP dopo trattamento di 1 ora
con H2O2, usata come controllo positivo, e NPs di SiO2 (100 g/ml) per diversi tempi. *
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5. CONCLUSIONI
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104 Oggi i NMTs hanno avverato la profezia di Feynman, il quale aveva ipotizzato che nel futuro si sarebbero realizzati nuovi prodotti operando direttamente sulla posizione degli atomi nella materia. I NMTs stanno assumendo sempre maggiore interesse tanto che, si stima attorno a 800 il numero di prodotti presenti sul mercato contenenti materiali di dimensioni nanometriche.
Tuttavia, come emerso dalla letteratura, le nanoparticelle (NPs) derivanti dalla combustione sono considerate la componente più nociva dell’inquinamento atmosferico, responsabili dell’aumento di morbilità cardiovascolare e morte per ischemia miocardica, aritmia e infarto (15,21,43,50). Nonostante ciò, a causa di una limitata conoscenza delle proprietà chimico-fisiche dei NMTs e della loro interazione con i sistemi biologici, la comunità scientifica non ha ancora raggiunto una sufficiente comprensione del reale rischio associato all’esposizione di NPs e NMTs ingegnerizzati.
La limitata conoscenza degli effetti dei NMTs è data anche dal fatto che questi presentano spesso caratteristiche completamente diverse dagli stessi materiali di dimensioni atomiche o sub micrometriche. Di conseguenza, gli effetti dei NMTs non possono semplicemente essere dedotti dagli studi sui materiali in forma molecolare o di massa, ma richiedono l’impiego di norme e protocolli su misura per i NMTs stessi. Nei nostri studi abbiamo valutato l’effetto di dosi crescenti di alcune NPs di nuova sintesi (TiO2, SiO2 e ZrO2) sulla fisiologia di una linea di
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105 proposta come un modello adatto a fornire nuove risposte sui meccanismi che regolano la biologia endoteliale sia in condizioni fisiologiche sia in condizioni patologiche (14,35,36,55,77)
La cellula endoteliale è una componente di primaria importanza per il corretto funzionamento del sistema cardiovascolare. Infatti, il danno o disfunzione di questo tipo cellulare è ormai estensivamente accertato essere alla base dell’insorgenza e progressione di patologie cardiovascolari quali il diabete, ipertensione e arteriosclerosi (26).
Riteniamo, quindi, che le ECV 304 siano un buon modello cellulare per investigare l’impatto delle NPs in esame sulla fisiologia del sistema vascolare.
Nel nostro studio, abbiamo inizialmente studiato la forma e le dimensioni delle NPs, mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) e a trasmissione (TEM). Tutti i lotti di NPs esaminati sono risultati simili e hanno presentato forma sferica, superficie liscia e dimensioni omogenee (diametri medi compresi tra 190 e 230 nm). Abbiamo continuato la caratterizzazione delle NPs con la misurazione della fluorescenza legata alle NPs funzionalizzate con fluoresceina di isotiocianato (FITC), mediante spettrofotometro. La fluorescenza misurata è risultata, tranne che per le NPs di SiO2, direttamente
proporzionale alla quantità di NPs.
Nel nostro studio, abbiamo valutato la vitalità e proliferazione cellulare dopo trattamento per tempi diversi con dosi scalari di NPs. Con il test MTT, impiegato per valutare la vitalità cellulare, non è stata osservata
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106 alcuna differenza tra le cellule trattate e quelle di controllo. Nel test con il trypan blue, invece, si è osservato un effetto citotossico tempo e dose dipendente. I diversi risultati osservati con i due test sono probabilmente da imputare a un’interferenza delle nanoparticelle con le componenti del test MTT, come già emerso in letteratura per altre nanoparticelle (31). Una possibile interferenza è stata ipotizzata anche nei test eseguiti con BrDU e CyQuant, impiegati per valutare la proliferazione cellulare in termini di sintesi di DNA. Anche in questo caso non abbiamo osservato alcuna differenza tra le cellule trattate con le diverse concentrazioni di NPs e le cellule di controllo. Riteniamo che questi risultati siano molto interessanti, poiché evidenziano l’importanza di utilizzare più test per valutare la potenziale citotossicità di questi nanosistemi.
Si è dimostrato, inoltre, che le NPs di TiO2 e SiO2 inducono apoptosi in
maniera tempo e dose dipendente, confermando i risultati sulla citotossicità e suggerendo un potenziale meccanismo di morte cellulare. L’induzione di apoptosi da parte delle NPs è stata ulteriormente suggerita dagli esperimenti di immunofluorescenza con il Citocromo C.
Infatti, almeno per quanto riguarda le NPs di SiO2, si è evidenziato un
rilascio del citocromo C intra-mitocondriale dopo trattamento con NPs. I due set di esperimenti eseguiti con il JC-1 e la MTX-roGFP, oltre a fornire dettagli meccanicistici sulla citotossicità delle NPs, confermano l’evento apoptotico, evidenziando, il primo una perdita del potenziale di membrana mitocondriale (MMP), mentre il secondo una ossidazione del comparto cellulare interno al mitocondrio, entrambi eventi fortemente associati al fenomeno apoptotico.
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107 In seguito si sono condotti una serie di esperimenti atti a evidenziare l’ingresso delle NPs all’interno delle cellule. Una conferma in tal senso indicherebbe una possibile via attraverso la quale le NPs potrebbero indurre il danno osservato. Sia gli esperimenti al fluorimetro sia gli esperimenti al microscopio a fluorescenza hanno evidenziato un aumento di fluorescenza associata alle cellule dopo trattamento con NPs funzionalizzate con la FITC, suggerendo una possibile internalizzazione cellulare di queste. L’osservazione al microscopio elettronico a trasmissione ha difatti evidenziato l’inclusione intracellulare delle NPs. Vacuoli contenenti nanoparticelle sono stati, infatti, osservati nel citoplasma di sezioni cellulari esaminate al TEM anche dopo il solo trattamento di un’ora. Questo suggerisce una possibile interazione delle NPs con organelli interni alla cellula (e.g. mitocondrio), dalla quale potrebbe originare lo stress ossidativo osservato e la conseguente citotossicità.
In conclusione, i risultati ottenuti hanno dimostrato che elevate dosi di NPs hanno effetti citotossici per la cellula. L’evidenziato ingresso nella cellula delle NPs potrebbe essere alla base dello stress ossidativo osservato in termini di aumento di ROS. Una perdita di MMP, in associazione a un’ossidazione del comparto mitocondriale potrebbe essere il risultato di un’interazione di queste con i mitocondri, evento finale nell’induzione del fenomeno apoptotico come evidenziato dal rilascio di citocromo C e dall’apopercentage.
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6. BIBLIOGRAFIA
Bibliografia
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