Materiali e metodi
Dott.ssa Stefania Punzoni
Sintesi, caratterizzazione ed analisi degli effetti biologici delle nanoparticelle di TiO2, SiO2 e ZrO2 su cellule endoteliali umane
Tesi di dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche - Università Degli Studi di Sassari
33
3.1 Scelta delle nanoparticelle
In questo studio si sono testate le NPs di Titania (TiO2), Silice (SiO2) e
Zirconia (ZrO2), funzionalizzate e non con fluoresceina di isotiocianato
(FITC), gentilmente fornite dalla Dott.ssa Vanna Delogu, presso Porto Conte Ricerche.
La funzionalizzazione con una sonda fluorescente come la FITC ha lo scopo di permettere sia la quantificazione sia la localizzazione intracellulare delle NPs oggetto di studio. La FITC ha un massimo di assorbimento a 490-495 nm ed emette una luce giallo-verde a 517 nm, rilevabile al microscopio a fluorescenza o mediante analisi fluorimetrica.
Sulle NPs di TiO2 e SiO2 esistono diversi studi atti a valutare una loro
potenziale tossicità, mentre scarseggiano quelli relativi alle NPs di ZrO2.
NPs di TiO2 sono ampiamente usate come pigmenti bianchi nella
produzione di vernici, carta e plastica o in prodotti alimentari (56).
L’impiego delle NPs di TiO2 ha coinvolto anche altri settori industriali
come quello cosmetico e farmaceutico (21). Particelle nanometriche di TiO2, grazie alle loro proprietà di filtri UV, sono presenti in alcune
creme di bellezza e in creme solari per protegge la pelle dai raggi UV-A
(61). Tuttavia, da alcuni studi le NPs di TiO2 sono risultate dannose per
la salute umana. Infatti, le NPs di TiO2 possono depositarsi nei tessuti
polmonari e causare infiammazione polmonare, danno polmonare simile all’enfisma, fibrosi e danno al DNA in animali da esperimento (48,72).
NPs di TiO2 sono state ritrovate anche nel fegato, nei reni e nella milza,
Materiali e metodi
Dott.ssa Stefania Punzoni
Sintesi, caratterizzazione ed analisi degli effetti biologici delle nanoparticelle di TiO2, SiO2 e ZrO2 su cellule endoteliali umane
Tesi di dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche - Università Degli Studi di Sassari
34 assorbimento da parte del tratto gastrointestinale e respiratorio (28). E’ stata anche rivelata la capacità delle NPs di attraversare la barriera ematoencefalica (72).
La produzione commerciale di NPs di SiO2 è iniziata negli anni ’30 dello
scorso secolo e ha acquisito un’importanza sempre maggiore. Le NPs di
SiO2 trovano un largo impiego industriale per svariate applicazioni che
vanno dalla chiarificazione delle bevande, all’utilizzo come additivi per polimeri, vernici, rivestimenti e detergenti per la loro capacità di migliorare le proprietà di resistenza, brillantezza e adesione delle superfici fino al recente impiego in prodotti cosmetici. Per quanto
riguarda altre possibili applicazioni, le NPs di SiO2 contenenti molecole
fluorescenti organiche stanno attraendo molta attenzione in campo
biomedico come traccianti per applicazioni diagnostiche,
somministrazione mirata dei farmaci e cura dei tumori (75).
Nonostante il largo impiego delle NPs di SiO2, esistono in letteratura
studi che evidenziano alcuni loro effetti tossici. Si sono osservate alterazioni cardiovascolari e polmonari in ratti anziani dopo inalazione
di NPs di SiO2. L’esposizione a NPs di SiO2 è associata anche a danno
Materiali e metodi
Dott.ssa Stefania Punzoni
Sintesi, caratterizzazione ed analisi degli effetti biologici delle nanoparticelle di TiO2, SiO2 e ZrO2 su cellule endoteliali umane
Tesi di dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche - Università Degli Studi di Sassari
35
3.2 Sintesi delle nanoparticelle
I reagenti chimici impiegati per la sintesi delle NPs sono stati acquistati dalla Sigma-Aldrich ed utilizzati senza ulteriori modifiche.
Le NPs di SiO2, TiO2 e ZrO2 sono state sintetizzate con un nuovo
metodo di preparazione basato sulla tecnica sol-gel (Fig. 3) che prevede l’idrolisi (a) e la successiva condensazione (b) di precursori alcossidici catalizzata da basi, a temperatura ambiente. I precursori (1 g), tetraetilortosilicato (TEOS), titanio butossido (Ti(OBu)4) e zirconio
isopropossido (Zr(OPr)4), rispettivamente, sono stati solubilizzati in
etanolo (7,3 ml) e addizionati di una soluzione di ammoniaca concentrata (13,4 ml). Le NPs, ottenute come precipitati bianchi, sono state successivamente purificate mediante centrifugazione e lavaggio con etanolo ed acqua per allontanare dalla superficie l’eventuale materiale non reagito. Il prodotto solido così isolato è stato essiccato a 60°C per 12 ore.
Materiali e metodi
Dott.ssa Stefania Punzoni
Sintesi, caratterizzazione ed analisi degli effetti biologici delle nanoparticelle di TiO2, SiO2 e ZrO2 su cellule endoteliali umane
Tesi di dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche - Università Degli Studi di Sassari
36 Le stesse NPs funzionalizzate sulla superficie con Fluoresceina isotiocianato (FITC) sono state sintetizzate, mediante una reazione one-
pot, utilizzando la tecnica descritta (Fig. 4). La FITC (5 mg) è stata
prima coniugata covalentemente con amminopropiltrietossisilano (APTES) (10 l) attraverso una reazione di addizione, in soluzione etanolica, dell’ammina dell’APTES con il gruppo isotiocianato della FITC, come mostrato nello schema. Il coniugato addizionato al mezzo di reazione contenente i precursori porta alla formazione di un coating mediante legame covalente con i gruppi idrossilici esposti sulla superficie delle NPs.
Materiali e metodi
Dott.ssa Stefania Punzoni
Sintesi, caratterizzazione ed analisi degli effetti biologici delle nanoparticelle di TiO2, SiO2 e ZrO2 su cellule endoteliali umane
Tesi di dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche - Università Degli Studi di Sassari
37
3.3 Caratterizzazione delle nanoparticelle
La morfologia (forma e superficie) delle NPs è stata studiata mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) (modello ESEM-FEI Quanta 200, FEI Company, Hillsboro, OR, USA) e in trasmissione (TEM) (Zeiss M109 turbo, Zeiss, Germania).
Per l’analisi al SEM, i campioni di NPs sono stati fissati su supporti di alluminio e rivestiti con una lamina d’oro dello spessore di 25 nm (gold sputtering), allo scopo di riprodurre esattamente la forma delle particelle solide; il campione inserito nel probe dello strumento è, quindi, investito da un fascio di elettroni primari dotati di un potenziale di accelerazione di 20kV; a seguito della collisione di questi con la lamina d’oro, vengono emessi elettroni secondari a minore energia che sono raccolti ed utilizzati per variare l’intensità dello spot su uno schermo televisivo che si muove in sincronia con il fascio di elettroni. Le immagini così ottenute sono state fotografate a diversi ingrandimenti.
I campioni per l’analisi al TEM sono stati depositati su una griglia di rame (400 mesh) rivestita con un film Formvar. Dopo diluizione delle
particelle in H2O, una goccia di campione è stata depositata sulla griglia
ed il solvente è stato lasciato evaporare a temperatura ambiente. Anche in questo caso, le immagini sono state fotografate a diversi ingrandimenti.
Le dimensione delle NPs sono state calcolate dalle foto con il programma Imagine Tool Version 3.0. I valori di diametro medio e rispettive deviazioni standard sono relativi a n=100 particelle.
Materiali e metodi
Dott.ssa Stefania Punzoni
Sintesi, caratterizzazione ed analisi degli effetti biologici delle nanoparticelle di TiO2, SiO2 e ZrO2 su cellule endoteliali umane
Tesi di dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche - Università Degli Studi di Sassari
38