Il protocollo per l’esame immunoistochimico per valutare l’espressione delle proteine PTEN e delle E-caderine è lo stesso per entrambi i marker e in particolare è stato utilizzato un metodo streptavidina-biotina perossidasi.
I campioni istologici, dopo essere stati inclusi in paraffina con il metodo precedentemente descritto per l’analisi istopatologica sono tagliati in sezioni dello spessore di 4μm.
Le sezioni sono state montante su vetrini Superfrost Plus slides (Thermo Fisher Scientific, Menzel GmbH & Co., Braunshweig, Germany) e poste in stufa durante la notte.
Le sezioni di tessuto sono state sparaffinate in xylene, e reidratate grazie al passaggio prima in alchool a 100°, successivamente in alchool a 96° e infine in acqua deionizzata. Poiché la capacità di esprimere un antigene (nel nostro caso PTEN e le E-caderine) può essere compromessa dalle procedure di fissazione del tessuto (Shi et al., 2001), segue una fase, chiamata “Antigen Retrieval” che consiste, mediante la sottoposizione della sezione a specifiche temperature e Ph, di ripristinare l’espressione antigenica.
Essa consente di smascherare gli antigeni, che legandosi agli anticorpi, permettono la reazione immunoistochimica, rendendosi così visualizzabili.
La fase di Antigen Retrieval è stata condotta mediante l’utilizzo di un buffer citrato a pH 6.0; i vetrini immersi in questo mezzo hanno subìto due cicli ad alta temperatura in forno a microonde, il primo per 4 minuti a 650 W e il secondo per 15 minuti a 350 W. Al termine di questa tappa questi sono stati refrigerati a temperatura ambiente per 20
minuti e montati con il sitema Shandon Sequenza (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA) per la colorazione IHC.
Poichè il metodo utilizzato in questa fase è streptavidina-biotina perossidasi, quelle endogene sono state inibite con 100 μL di soluzione bloccante Dako Real (Dako, Glostrup, Denmark) per 10 minuti.
Le sezioni sono state quindi sciacquate con tre lavaggi in “Tween Tris-buffered saline solution” (TBST) a pH 7.6.
Per ridurre il background prodotto dell’interazione idrofobica delle proteine, le sezioni sono state incubate per 10 minuti con 100 μL di soluzione Ultra V Block (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA).
Dopo tre lavaggi in TBST, le sezioni sono state incubate con gli anticorpi primari diluiti in TBST per 1 ora a temperatura ambiente.
Gli anticorpi primari riconoscono l’antigene, se è presente nel tessuto esaminato; esso può essere monoclonale o policlonale. I primi sono normalmente prodotti in topi, e hanno un’alta specificità e una bassa sensibilità rispetto ai secondi (Ramos-Vara, 2005). Questi, invece, sono maggiormente prodotti nel coniglio e nella capra e presentano un’alta sensibilità e una bassa specificità (Ramos-Vara, 2005).
In questo caso per PTEN sono stati utilizzati anticorpi monoclonali di topo (clone A2B1, diluito 1:50) e per le E-caderine anticorpi policlonali di coniglio (diluito 1:300) Secondariamente ad un successivo risciacquo con tre lavaggi di TBST, le sezioni sono state incubate per 30 minuti con un anticorpo biotinilato secondario polivalente (Vectastain, Vector Labs Inc., Burlingame, CA, USA), che riconosce il frammento FC dell’anticorpo primario, il quale è lo stesso per tutti gli anticorpi della stessa specie animale.
Dopo tre lavaggi, le sezioni hanno subìto un passaggio in una soluzione con complesso streptavidina-perossidasi (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA), seguita da altri tre risciacqui con TBST.
La streptavidina del complesso streptavidina perossidasi lega la biotina dell’anticorpo secondario, mentre le perossidasi rimangono libere al termine della catena.
Per sviluppare la reazione di perossidasi, e quindi rivelare l’assenza o la presenza e/o l’eventuale localizzazione dell’antigene all’inizio del processo, le sezioni sono state incubate con il Diaminobenzidine (Impact DAB, Vector Labs, Inc., Burlingame, CA, USA) per 10 minuti, in seguito esse sono state risciacquate in acqua deionizzata e poi i vetrini sono stati rimossi dal sistema Shandon Sequenza.
Dopo una colorazione di contrasto in ematossilina per 45 secondi, i campioni sono stati disidratati attraverso il passaggio in alchool a 96° e a 100°, quindi dopo due lavaggi in xylene sono montanti con vetrino copri-oggetti.
Alla fine di questa procedura le cellule positive presenteranno una colorazione marrone nel compartimento cellulare dove si troverà l’antigene.
Come controlli positivi, per PTEN sono stati utilizzati glomeruli renali canini e endotelio vascolare (Koening et al., 2002) e per le E-caderine campioni di cute e fegato di cane. I controlli negativi sono stati creati omettendo l’anticorpo primario al momento dell’incubazione e sostituendolo con soltanto TBST.
5.3.2 - Sistema di valutazione dell’Immunoistochimica
PTEN e le E-caderine, in condizioni fisiologiche, si trovano in due compartimenti cellulari diversi, ossìa il citoplasma per il primo e la superficie della membrana cellulare per le seconde, in particolare esse rivestono il loro ruolo onco-soppressivo soltanto
quando si trovano effettivamente sul bilayer fosfolipidico, condizione definita come espressione preservata (Sarli et al, 2004).
Per questo motivo per la valutazione immunoistochimica dei campioni sono stati usati due differenti sistemi di classificazione.
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Valutazione dell’espressione di PTENÈ stato usato il sistema di quantificazione dell’espressione della proteina, utilizzato in medicina umana e felina, già descritto dapprima da Seow e colleghi nel 2010 e in seguito da Maniscalco e colleghi nel 2012.
Esso considera la diffusione, valutata considerando la percentuale di cellule positive e l’intensità del segnale immunoistochimico in 10 campi microscopici ad alto ingrandimento (x400) (vedi tabella 5a e 5b).
·Tabella 5a - Valutazione della diffusione del segnale IHC
% di cellule positive Punteggio
nessuna cell + 0
1-25% di cell + 1
26-50% di cell + 2
51-75% di cell + 3
·Tabella 5b - Valutazione dell’intensità del segnale IHC
Facendo la somma tra i punteggi ottenuti dalla valutazione della diffusione e dell’intensità della colorazione si ottiene una valutazione finale.
Sono stati considerati quindi positivi i campioni con punteggio complessivo ≥ 3 (Seow et al, 2012).
·Valutazione dell’espressione delle E-caderine
È stata valutata con lo stesso sistema ustato da Brunetti e colleghi in tre diversi studi sui CMT (Brunetti et al, 2003).
Come menzionato nei capitoli precedenti, le E-caderine possono giocare il loro ruolo onco-soppressivo soltanto quando sono localizzate sulla superficie della membrana cellulare, una condizione definita come espressione preservata (Sarli et al, 2004).
Sono stati considerati positivi i campioni presentanti più del 75% di cellule con un pattern membranoso continuo (Brunetti et al, 2005).
Quantità di colorazione Punteggio
scarsa 1
moderata 2