ANALISI MOLECOLARE DEI CAMPIONI DI DNA DAI PRODOTTI COMMERCIAL

6.5.1 Disegno del primers reverse interni per l’amplificazione del frammento corto del gene COI.

In considerazione del livello di degradazione del DNA evidenziato dall’analisi su gel elettroforetico, abbiamo deciso di disegnare dei primer reverse interni per l’amplificazione di frammenti più corti del gene COI, in combinazione con il forward FFDL. A tal fine, le sequenze prodotte in questo studio sono state allineate con quelle recuperate dai Databases pubblici (75 sequenze appartenenti a 14 specie di 5 diverse famiglie di Rhizostomeae e 54 sequenze appartenenti ad 11 specie di 3 diverse famiglie di Semaestomeae) ed usate per disegnare i primers reverse interni (Fig 6.2). I reverse interni disegnati all’interno della sequenza di Folmer (Tab. 6.3) sono stati testati su una su tutti i DNA provenienti estratti dagli esemplari morfologicamente identificati. Anche in questo caso i primers selezionati sono stati muniti di una coda oligonucleotidica (Steffen et al. 1992) per la standardizzazione del sequenziamento dei prodotti di PCR. I protocolli di amplificazione per i frammenti inferiori a 500bp differiscono da quelli ottimizzati per il frammento di Folmer nella temperatura di annealing e nel tempo di estensione, che sono rispettivamente di 50°C e di 20 secondi.

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6.5.2 Amplificazione del DNA dei prodotti commerciali.

I protocolli sviluppati sono stati utilizzati per l’amplificazione del DNA estratto dai prodotti commerciali, secondo il pattern di frammentazione evidenziato nell’elettroforesi su gel. Anche utilizzando concentrazioni crescenti di DNA (da 100 a 500ng) l’amplicone è stato ottenuto soltanto dal DNA di cinque campioni di RE.

6.5.3 Valutazione degli inibitori della PCR e sviluppo di un metodo per l’estrazione del DNA dai prodotti commerciali

Per valutare la presenza di inibitori della PCR nel DNA estratto dai campioni commerciali di medusa è stato utilizzato il DNA di tre campioni di N. nomurai (controllo positivo) insieme a tre campioni di prodotti RE ed altrettanti tre di prodotti PC. In particolare, sono state effettuate le seguenti prove:

- Test di diluizione seriale: da ogni campione sono state preparate tre differenti diluizioni (10,1, 0.1 ng/µL) in acqua (DNAse free).

- Spiking test: Il DNA estratto da N. nomurai è stato diluito con diverse percentuali di DNA estratto da campioni RE e PC (10%, 50% e 100%) e con acqua (DNAse

free) al fine di raggiungere una concentrazione di 100 ng/µL.

- Purificazione del DNA estratto: Il DNA ottenuto con il metodo di estrazione standard è stato purificato con il kit di purificazione Agencourt® AMPure®XP PCR Purification (Beckman Coulter, Beverly, Massachusetts, USA) seguendo le istruzioni fornite dalla casa produttrice e, dopo essere stato quantificato, è stata preparata una soluzione di 100 ng/µL.

Tutti i campioni preparati sono stati poi amplificati nelle condizioni di PCR precedentemente descritte, tenendo in considerazione il grado di degradazione del DNA.

6.5.4 Sviluppo del metodo per l’estrazione del DNA dai prodotti commerciali

Su dieci prodotti commerciali (cinque RE e cinque PC) sono state testate dei pre- trattamenti pre-estrattivi. I campioni sono stati sminuzzati grossolanamente con delle forbicine e poi trattati in modo diverso secondo il seguente schema:

1. Desalati sotto acqua corrente a temperatura ambiente per 24, 48 o 72 ore;

2. Incubati in quattro diverse soluzioni di EDTA (50,100,200,400 mM) per un’ora a temperatura ambiente nel thermoshaker;

3. Procedure 1 e 2 insieme.

L’estrazione del DNA totale è stata poi effettuata secondo quanto descritto da Armani et

120 frammentazione sono stati determinati come riportato nei paragrafi 6.3.1 e 6.3.2, infine, tutti i campioni sono stati amplificati secondo le condizioni di PCR descritte nel paragrafo 6.4.3, scegliendo i primers reverse sulla base del livello di degradazione del DNA totale. Per l’analisi dei prodotti commerciali è stata scelta la procedura di pretrattamento n°3, con un tempo di desalatura sotto acqua corrente di 24-48 ore ed un’incubazione in una soluzione di EDTA 400 mM per un’ora a temperatura ambiente.

6.5.5 Protocollo di amplificazione finale, sequenziamento ed analisi delle sequenze dei prodotti commerciali

Il protocollo finale scelto per l’amplificazione dei prodotti commerciali è stato il seguente: volume di reazione di 20 µl totali, contenente 2 µl di buffer PCR 10x (5Prime, Gaithersburg, USA), 200 mM di ogni dNTP, 300 nM di primers, 25ng/ µl di BSA, 100 ng di acqua libera da DNA e DNasi. La concentrazione di della DNA Polimerasi PerfectTaq è stata aumentata a 2,5 U, mentre il programma è stato aumentato a 45 cicli.

Tutti i prodotti commerciali sono stati amplificati secondo le suddette condizioni e controllati tramite corsa elettroforetica, purificati ed inviati ad un laboratorio esterno (BMR Padova) per l’analisi di sequenziamento.

Le sequenze prodotte sono state allineate e corrette manualmente utilizzando il programma Clustal W integrato in MEGA versione 5.10 ed analizzate come riportato nel paragrafo 6.4.3. Le sequenze prodotte sono state quindi depositate in GenBank.

6.5.6 Analisi filogenetica

54 sequenze ottenute dai campioni identificati e 78 sequenze ottenute dai prodotti commerciali sono state allineate con 60 sequenze di meduse (Tab 6.4), appartenenti all’Ordine delle Rhizostomeae e delle Semaeostomeae, recuperate da GenBank, utilizzando il programma Clustal W in MEGA versione 5.10 (tabella dei 3SM da utilizzare qui). Laddove è stato possibile, sono state recuperate dal database cinque differenti sequenze per ogni specie. Solo nel caso di Aurelia spp., genere al quale recenti studi hanno attribuito almeno 14 specie diverse, sono state recuperate più di cinque sequenze (Tab.6.4). Per l’analisi filogenetica è stato selezionato un frammento di 142 bp appartenente al gene COI. Il dendrogramma Neighbour-joining (NJ) è stato ottenuto utilizzando il programma MEGA version 5.10 e le distanze sono state calcolate con il modello Kimura 2-parametri con 2000 bootstraps di re-sampling.

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Tab.6.4: Sequenze raccolte da GenBank ed utilizzate per l’analisi filogenetica. (tratto da: Armani et al.2013 doi:10.1016/j.foodres.2013.10.003)

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CAPITOLO 7