MATERIALI E METOD
12. ANALISI STATISTICA SU DATI ISTOLOGIC
Nel secondo studio comparativo gli stessi campioni sono stati suddivisi in classi basate sulla diagnosi istologica, successiva ad intervento chirurgico, e i carcinomi „veri‟ sono stati confrontati con i noduli adenomatosi.
Ad esempio il campione 118 era stato erroneamente diagnosticato come benigno, ma l‟esame istologico ha deposto per carcinoma confermando la predittività del profilo d‟espressione dei marcatori tumorali rilevati dall‟analisi dei dati citologici.
In questa seconda analisi, è stato possibile definire un profilo di picchi rilevati nella popolazione dei cancri che costituisce un‟impronta univoca e caratteristica di un generico carcinoma tiroideo. Quindi, lo studio delle differenze con il profilo dei noduli benigni dà come risultato l‟identificazione di una serie di valori m/z, associabili a potenziali biomarcatori, che discriminano le lesioni maligne dalle benigne.I valori m/z relativi sono concentrati nella gamma compresa tra 8 e 20 KDa (figure 23, 24, 25).
I clusters selezionati dal valore p calcolato mediante Test t-Student sono stati 20 per Q10 (Tab.7), 9 per IMAC (Tab.8) e 14 per CM10 (Tab.9). Sono stati rilevati alcuni picchi già significativi nell‟analisi con dati citologici, segno della loro intrinseca accuratezza, che non viene persa in una lieve dispersione dei valori. Tra i microfollicolari operati chirurgicamente, 5 si sono rilevati carcinomi, altri 5 lesioni benigne. Tra questi ultimi in particolare è stato osservato che il campione 122 aveva un comportamento affine ai cancri.
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Infatti, quando la dispersione dei valori dalla media risulta ben distribuita, nella classe dei benigni si evidenzia il campione 122 che, in più valori m/z, fuoriesce dal gruppo e segue l‟andamento dei cancri (Fig.26).
Lo stesso campione è identificato come similare ai maligni nel grafico a dispersione bidimensionale PCA (fig.27) e nel grafico ad albero (dendrogramma, fig.28). Quindi, il pannello di potenziali biomarcatori tumorali è rappresentato dall‟insieme dei valori m/z che presentano differenze significative tra le medie delle due popolazioni. Con queste informazioni è stato possibile selezionare i noduli a citologia microfollicolare senza diagnosi istologica, con profilo analogo a quello dei carcinomi, per differenziarli da quelli paragonabili con i benigni.
Figura 23 ProteinChip®Q10:il grafico mostra i clusters statisticamente significativi dall’analisi
statistica con dati istologici delle classi cancri e benigni. Ogni quadrato, la rappresentazione grafica di un cluster,è posizionato in base al proprio valore m/z (asse X), l’area del quadrato è inversamente proporzionale al proprio ‘valore p’.
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Figura 24 ProteinChip® IMAC-Cu++: il grafico mostra i clusters statisticamente significativi dall’analisi statistica con dati istologici delle classi cancri e benigni. Ogni quadrato, la rappresentazione grafica di un cluster,è posizionato in base al proprio valore m/z (asse X), l’area del quadrato è inversamente proporzionale al proprio ‘valore p’.
Figura 25 ProteinChip®CM10: il grafico mostra i clusters statisticamente significativi dall’analisi
statistica con dati istologici delle classi cancri e benigni. Ogni quadrato, la rappresentazione grafica di un cluster, è posizionato in base al proprio valore m/z (asse X), l’area del quadrato è inversamente proporzionale al proprio ‘valore p’.
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Tabella 7 ProteinChip®Q10:elenco dei clusters con differenze delle medie d’intensità significative tra le
classi diagnostiche cancri e benigni, relativi valori p: con p<0,05 ( * ), p<0,01 ( ** ) e p<0,001 ( *** ) e l’andamento della media delle intensità di cancro rispetto alla media delle intensità del benigno.
Q10
p-value ANDAMENTO 6639 0,000819 7944 0,00337 8700 6,63E-6 8820 0,000334 8929 0,00014 9144 0,000208 9432 0,000181 12626 4,5E-7 13780 0,03335 * 15890 0,00735 16098 0,002283 16520 0,000274 17282 7,24E-6 17410 0,000164 17616 3,78E-7 33460 1,13E-5 44380 3,4E-7 66975 9,5E-10 79498 3,97E-7 97539 0,00413 97
Tabella 8 ProteinChip®IMAC30: elenco dei clusters con differenze delle medie d’intensità significative
tra le classi diagnostiche cancri e benigni, relativi valori p: con p<0,05 ( * ), p<0,01 ( ** ) e p<0,001 ( *** ) e l’andamento della media delle intensità di cancro rispetto alla media delle intensità del benigno.
IMAC30
p-value ANDAMENTO5931 0,045 * 6128 0,047 * 7588 0,0079 ** 9299 0,0445 * 9949 0,0225 * 20942 0,0347 * 28110 0,0487 * 41181 0,0185 * 82154 0,01385 *
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Tabella 9 ProteinChip® CM10:elenco dei clusters con differenze delle medie d’intensità significative tra
le classi diagnostiche cancri e benigni, , relativi valori p: con p<0,05 ( * ), p<0,01 ( ** ) e p<0,001 ( *** ) e l’andamento della media delle intensità di cancro rispetto alla media delle intensità del benigno.
CM10
p-value ANDAMENTO 6636 0,03688 * 16520 0,01877 * 17417 0,0365 * 30331 0,00338 ** 31085 0,01114 * 31829 0,00907 ** 33386 0,0054 ** 45595 0,01395 * 46303 0,0139 * 47036 0,0117 * 47729 0,0086 ** 51418 0,00123 ** 66714 0,00397 ** 79251 0,003 ** 99 m/z 8823 m/z 8928 m/z 9144 m/z 9432 m/z 12626 m/z 66975
Figura 26 ProteinChip®Q10:i valori m/z relativi alle distribuzioni vengono riportati a lato, insieme
all’andamento () della media d’intensità dei cancri (gruppo in blu) rispetto alla media d’intensità dei benigni (gruppo in rosso).E’cerchiato il campione 122, microfollicolare benigno.
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Figura 27 ProteinChip®Q10: analisi delle componenti principali (PCA)su grafico bidimensionale.
In rosso i campioni benigni, in nero i cancri. E’ ben evidente la distribuzione compatta dei benigni.
Figura 28 ProteinChip®Q10:dendrogramma.In nero i campioni benigni, in rosso i cancri, in verde i microfollicolari benigni e in blu i microfollicolari cancri.
-3,0 -2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 t[ 2 ] t[1] Q10 isto.M1 (PCA-X) t[Comp. 1]/t[Comp. 2]
Colored according to Obs ID (Primary)
R2X[1] = 0,695034 R2X[2] = 0,105857 Ellipse: Hotelling T2 (0,95) B2 B3 B4 B5 B6 B8 B9 B11B12 B13 B14 B15 B16 B18 B19 B20 B21 B25 B27 B28 B30 B34 B35 B37 B38 B39 B40 B122 B133 B138 C1 C32 C117 C118 C120 C121 C123 C124 C125 C126 C127 C129 C131 C132 C134 C136 SIMCA-P+ 12.0.1 - 2010-04-07 16:07:34 (UTC+1)
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Figura 29 ProteinChip®Q10: analisi statistica multivariata su dati istologici: PCA nelle tre dimensioni. In rosso i campioni appartenenti alla classe dei benigni, in giallo i cancri. E’ indicato il campione 122, appartenente alla classe dei benigni, che si distanzia dalla propria classe.
Campione 122
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In conclusione, l‟FNA, che contiene una miscela di proteine (sieriche, interstiziali e di secrezione), prodotte direttamente nell‟ambiente nodulare, potrebbe fornire informazioni proprio sulle proteine che subiscono variazioni o su quelle prodotte come conseguenza della trasformazione maligna.
Un gran numero di interventi chirurgici potrebbe essere evitato se venissero identificati nuovi marcatori tumorali proteici.
L‟analisi proteomica su FNA può essere utile per la scoperta dei biomarkers, può diventare una nuova risorsa nella diagnosi clinica, strumento rapido e preoperatorio, un valido sostegno per l‟esame citologico del FNA, riducendone gli errori diagnostici.
In questa tesi la tecnologia SELDI-TOF-MS è stata proposta per l‟analisi del proteoma di ago aspirato di noduli tiroidei e ha dimostrato di essere un promettente strumento per la ricerca clinica di biomarcatori, perché potenzialmente può ridurre la complessità dell‟intero proteoma del fluido.
Lo studio preliminare condotto in questa tesi e i risultati ottenuti lasciano ben sperare sulle potenzialità di questa analisi, ma è necessario allargare la ricerca con un maggior numero di campioni, in particolare per la classe microfollicolare, al fine di validare i risultati ottenuti.
La fase successiva verrà dedicata all‟identificazione delle proteine corrispondenti alle masse molecolari di interesse.
Infatti ad oggi il limite, comunque superabile, della tecnologia SELDI- TOF-MS è l‟incapacità di dare direttamente un‟identificazione delle masse molecolari.
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Per ottenere questo, una volta ottenuto il profilo di interesse, è necessario effettuare una serie di prefrazionamenti sul campione, al fine di ridurne la complessità in termini di numero di proteine e così riuscire a ritrovare i picchi di interesse. Le proteine appartenenenti alle singole frazioni potranno essere separate su gel monodimensionale, le bande con i pesi molecolari di interesse verranno quindi tagliate per l‟identificazione mediante LC/MS/MS.
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