MATERIALI E METOD
9. SELDI-TOF-MS: PROFILO PROTEOMICO DI FNA
9.1 Materiali e strumentazione
L‟acqua, di grado analitico, è stata filtrata mediante l‟apparecchio MilliQ (PS Whatman®, Millipore Corporation, Maid Stone, England).
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate
(CHAPS), urea e HEPES sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO).
Tutti gli altri reagenti e i solventi sono stati acquistati dalle più comuni fonti commerciali.
ProteinChip® System serie 4000 (PCS4000) è stato prodotto da Bio-Rad Laboratories Inc (USA).
9.2 Reclutamento dei pazienti e raccolta dei campioni
I campioni di FNA sono stati forniti dal Prof. Tonacchera del Dipartimento di Endocrinologia, Facoltà di Medicina e Chirurgia dell‟Università di Pisa.
Per l‟inclusione nello studio tutti i pazienti reclutati hanno dato consenso informato.
Lo studio è stato condotto su 66 donne (età media±SD: 48.9± 11.62) e 18 uomini (età media±SD: 49.5±11.50).
La casistica è costituita da 51 pazienti a cui è stato diagnosticato un nodulo tiroideo benigno, 14 pazienti con diagnosi citologica sospetta di carcinoma e 19 pazienti in cui l‟esame citologico ha deposto per nodulo
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tiroideo microfollicolare, isolato o nel contesto di un gozzo multinodulare.
I pazienti con nodulo tiroideo benigno rappresentano i campioni di controllo che non saranno sottoposti ad intervento chirurgico.
L‟analisi istologica, avvenuta successivamente all‟operazione chirurgica, è stata eseguita per 10/19 pazienti con nodulo micro follicolare e per tutti i pazienti con diagnosi citologica di carcinoma tiroideo.
L‟esame ha deposto per la natura maligna della lesione in 14/14 (100%) pazienti con diagnosi citologica di nodulo maligno e in 5/10 (50%) degli interventi eseguiti per i pazienti con nodulo microfollicolare.
Raccolta dei campioni: dopo ago aspirazione nel nodulo tiroideo, il campione viene raccolto per l‟analisi citologica e la siringa viene lavata con 300 µl di soluzione fisiologica. La soluzione di lavaggio è immediatamente raccolta in eppendorf, posta in opportuno contenitore con ghiaccio e al più presto trattata per evitare fenomeni di degradazione proteica.
Quindi il lavaggio di FNA viene centrifugato a 2300x g per 10 min a 4°C, per rimuovere il materiale cellulare.
I risultanti sovranatanti sono conservati a -80°C o utilizzati per il nostro studio. Una piccola aliquota è usata per il dosaggio proteico DC/BIORAD.
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9.3 Dosaggio proteico DC / BIORAD
Il DC protein assay è un dosaggio colorimetrico basato come principio sul saggio di Lowry. Il dosaggio è basato sulla reazione delle proteine con una soluzione alcalina di tartrato di rame e con il reagente Folin. Ci sono 2 steps che portano alla colorazione: la reazione tra le proteine ed il rame che avviene a pH alcalino e la conseguente riduzione attuata da queste sul reagente Folin.
Lo sviluppo della colorazione è dovuto inizialmente agli amminoacidi tirosina e triptofano ed in seguito alla successiva estensione ai residui amminoacidici cistina, cisteina ed istidina presenti a livello proteico. Questi amminoacidi riducono il reagente Folin producendo diverse specie riducenti che hanno una caratteristica colorazione blu (con un massimo di assorbimento a 750 nm ed un minimo a 405 nm).
L‟assorbanza può essere misurata con sicurezza nell‟intervallo tra 650 e 750 nm.
La curva di riferimento dovrà essere preparata nello stesso tampone del campione proteico di interesse.
Nel nostro caso la proteina standard albumina bovina (BSA), è risospesa in acqua milliQ.
Vengono preparate cinque concentrazioni (con un volume di 20 µl) di proteina standard (0.3-0.6-1.2-1.8-2 mg/ml) che abbracciano l‟intervallo di sensibilità del metodo (Tab.1).
Per il dosaggio proteico del campione incognito si procede con una diluizione dello stesso con acqua per avere 20 µl di volume finale.
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Agli standards ed al campione sono aggiunti 100 µl di soluzione A*, si vortexa, quindi si aggiungono 800 µl della soluzione B, si vortexa e si attendono 30 minuti prima di leggere a 750 nm l‟assorbanza.
H2O milliQ BSA Concentrazione µg BSA
Bianco 20 µl - 0 µg/µl 0 µg 1 17 µl 3 µl 0.3 µg/µl 6 µg 2 14 µl 6 µl 0.6 µg/µl 12 µg 3 8 µl 12 µl 1.2 µg/µl 24 µg 4 2 µl 18 µl 1.8 µg/µl 36 µg 5 - 20 µl 2 µg/µl 40 µg
Tabella 1 Diluizioni della BSA per la retta di taratura.
Dalle letture di assorbanza ottenute con concentrazioni note di proteina standard si costruisce una retta di taratura nell‟intervallo di sensibilità da 5 µg a 37.5 µg:
y=Ax (A=assorbanza)
e dall‟equazione della retta si procede al calcolo della concentrazione proteica per il campione incognito:
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9.3.1 Interferenza dell‟emoglobina
Le concentrazioni calcolate si sono rivelate molto differenti tra i campioni, coprendo un ampio range (tra 1 e 100 µg/µl). E‟ stato ipotizzato che queste differenze fossero dovute alla diversa quantità di emoglobina (Hb) presente nei campioni. Infatti è una tra le proteine più concentrate nel fluido, è presente in una percentuale influente sul totale. Per ogni campione è stata calcolata la concentrazione dell‟Hb, che viene sottratta a quella totale calcolata nel dosaggio DC/Biorad ottenendo una
nuova concentrazione (
C
-HB).C-HB è stata tenuta in considerazione nel preparare le aliquote dei
campioni per l‟analisi alla spettrometria di massa. L‟assorbanza dell‟Hb viene misurata a 414 nm, lunghezza d‟onda alla quale possiede il massimo d‟assorbimento.
Per il dosaggio dell‟Hb del campione incognito si procede con una diluizione 1:100 dello stesso con acqua (10 µl in 990µl di acqua) per avere 1 ml di volume finale.
Il dosaggio viene effettuato in doppio, a temperatura ambiente.
Dalle letture d‟assorbanza ottenute si calcola la concentrazione dell‟Hb con la seguente equazione (A414= lettura campione; ε= 131000; PMHb=
68000; Fd= 100):
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9.4 Preparazione dei ProteinChip Arrays
Aliquote di FNA, corrispondenti a 10 µg di proteine (relative alla C-HB),
sono risospese in una soluzione detergente (rapporto campione/detergente; 2/3 v/v).
La soluzione è costituita da:
o CHAPS 2%, detergente non ionico per solubilizzare le proteine idrofobiche ed evitare aggregazioni;
o Urea 9M, per denaturare e solubilizzare il campione.
Le aliquote vengono vortexate, quindi rimangono in incubazione per 30 minuti, per ottenere una completa solubilizzazione e denaturazione del campione.
Possono essere immediatamente utilizzate per la fase sperimentale o conservate a –80°C.
La matrice utilizzata per la preparazione dei ProteinChip Arrays all‟analisi TOF-MS è l‟acido sinapinico (SPA).
Nella provetta, contenente 5 mg di SPA, sono aggiunti 100 µl di acido trifluoroacetico (TFA) 1% e 100 µl di aceto nitrile (ACN) puro.
Si vortexa per 5 minuti, si centrifuga 2 minuti a 13000xg ed infine si prelevano 150 µl di soluzione da diluire con 75 µl di TFA1% e 75 µl di ACN puro. La soluzione è pronta per l‟uso ed è conservata lontano da fonti luminose. Sono state testate diverse condizioni nella preparazione degli arrays per determinare un profilo ottimale in termini di numero e risoluzione dei picchi.
Di seguito vengono riportati i protocolli utilizzati per ciascun ProteinChip®Arrays.
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PROTOCOLLO
CM10
o Equilibratura della superficie dei pozzetti con due lavaggi di 5 minuti con 150 µl di Binding Buffer (sodio acetato 100 mM pH 4) o Caricamento del campione (corrispondente a 10 µg di proteine)
diluito in 100 µl di Binding Buffer e incubazione per 1h a temperatura ambiente
o Tre lavaggi da 5 minuti con 150 ul di Binding Buffer o Due lavaggi veloci con 150 µl di HEPES 5 mM pH 7
o Lasciare asciugare bene la superficie (per circa 10 minuti), quindi applicare la matrice con due deposizioni da 1 µl ciascuna, lasciando il tempo di asciugare tra una deposizione e l‟altra
o Incubazione di due ore al buio e lettura al ProteinChip® Reader
PROTOCOLLO
IMAC-Cu
++o Attivazione della superficie del chip con due lavaggi di 5 minuti con 100 µl di solfato di rame 100 mM (BioRad)
o Un lavaggio veloce con acqua
o Equilibratura con due lavaggi di 5 minuti con 150 µl di Binding Buffer (PBS pH 7.5 con NaCl 0,5 M - Triton 0.1%)
o Caricamento del campione (10 µg) diluito in 100 µl di Binding Buffer e incubazione per 1h a temperatura ambiente
o Due lavaggi da 5 minuti con 150 µl di Binding Buffer
o Un lavaggio di 5 minuti con 150 µl di PBS pH 7.5 con NaCl 0,5 M o Due lavaggi veloci con 150 µl di HEPES 5mM pH 7
o Lasciare asciugare bene la superficie (circa 10 minuti), quindi applicare la matrice con due deposizioni da 1 µl ciascuna
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PROTOCOLLO
Q10
o Equilibratura della superficie con due lavaggi di 5 minuti con 150 µl di Binding Buffer (Tris-HCl 100mM pH 8)
o Caricamento del campione (10 µg) diluito in 100 µl di Binding Buffer e incubazione per 1h a temperatura ambiente
o Tre lavaggi da 5 minuti con 150 µl di Binding Buffer(Tris- HCl100mM,pH8)
o Due lavaggi veloci con 150 µl di HEPES 5mM pH 7
o Lasciare asciugare la superficie (per circa 10 minuti), quindi applicare la matrice con due deposizioni da 1 µl ciascuna
o Incubazione di due ore al buio e lettura al ProteinChip® Reader
PROTOCOLLO
H50
o Attivazione della superficie con due lavaggi di 5 minuti con 50 µl di acetonitrile (ACN) 50%
o Equilibratura con due lavaggi di 5 minuti con 150 µl di Binding Buffer (ACN 10%, TFA 0,1%)
o Caricamento del campione (10 µg) diluito in 100 µl di Binding Buffer e incubazione per 1h a temperatura ambiente
o Tre lavaggi di 5 minuti con 150 µl di Binding Buffer o Due lavaggi veloci con 150 µl di HEPES 5 Mm pH 7
o Lasciare asciugare bene la superficie (per circa 10 minuti), quindi applicare la matrice con due deposizioni da 1 µl ciascuna
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9.5 Acquisizione degli spettri
I chips sono stati letti mediante il seguente protocollo: Focus Mass 15 KDa, Laser Energy 4000 nJoule, range di rivelazione 4-100 KDa.
La calibrazione è stata realizzata mediante 7 standards esterni di massa diversa, che ricoprivano l‟intervallo di massa desiderato (External Calibration).
L‟analisi degli spettri è stata effettuata utilizzando il ProteinChip Data Manager Software 3.5 (Bio-Rad Laboratories).
Nel processamento dei dati sono stati effettuati: allineamento degli spettri, selezionando almeno 4 picchi presenti in tutti gli spettri; sottrazione della linea di base, per eliminare il rumore di fondo; la normalizzazione delle intensità, nell‟intervallo dei valori di m/z 4-100 KDa, per eliminare gli effetti causati da fattori variabili come le imperfezioni della superficie del chip o la variazione nella quantità di proteine caricate. Gli spettri di massa dei campioni hanno rilevato un complesso, ma riproducibile, profilo di picchi.
Sono stati rivelati automaticamente i picchi aventi valori m/z tra 4 e 100 KDa, con rapporto S/N 6 e presenti almeno nel 20% degli spettri.
ProteinChip® Data Manager Software utilizza l‟applicazione Expression
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