Il concetto di scoperta di farmaci multitarget mediante un approccio fragment-based è stato suggerito da Morphy e Rankovic [5] sulla base delle relazioni proposte da Hann et al. [27], che mostrano retrospettivamente che la selettività tende ad aumentare con la complessità molecolare. Inoltre Hopkins et al. [8] hanno dimostrato una correlazione inversa tra peso molecolare e numero di target a cui si lega un composto. Nel loro insieme, queste osservazioni suggeriscono che lo screening fragment-based per targeting multipli al fine di identificare frammenti multitarget lead può offrire maggiori possibilità di successo rispetto agli approcci di screening con composti più grandi.
Sebbene la scoperta di ligandi multipli mediante la strategia fragment-based appaia come un approccio altamente promettente, il numero di studi prospettici di successo è limitato. La maggior parte di questi si basa sulla preselezione di frammenti in silico. Achenbach et al. [28] hanno eseguito uno screening fragment-based per identificare inibitori duali di sEH e 5-LO. Una libreria di frammenti disponibile in commercio è stata virtualmente valutata usando un algoritmo SOM (self-organizing map) adattato; il risultato sono stati 24 frammenti, con attività prevista verso entrambi i target, da essere sottoposti a validazione sperimentale in STD-NMR e test basati sull'attività. Cinque frammenti su 24 hanno mostrato attività inibitoria nei confronti di entrambi gli enzimi nei test di attività, mentre due strutture hanno mostrato un legame con entrambi i target nel test STD-NMR. Un frammento è stato selezionato, espanso e trasformato in un potente inibitore duale con elevata affinità (intervallo di concentrazione nanomolare) per entrambi i target.
Uno screening virtuale structure-based ha prodotto con successo inibitori duali della β-secretasi 1 (BACE-1) e della glicogeno sintasi-chinasi 3β (GSK-3β) [29]. Bottegoni et al. si sono basati sull'ipotesi della presenza di legami H comuni necessari per colpire entrambi gli enzimi ed hanno selezionato dei frammenti mediante ispezione visiva dopo una procedura di docking. In una successiva fase di screening, la procedura è stata ripetuta sui frammenti selezionati e su composti strutturalmente
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simili, consentendo l’identificazione di 27 frammenti per la valutazione sperimentale. Dallo screening funzionale basato sull’analisi NMR dei frammenti selezionati è risultato il composto 11 come inibitore di entrambi gli enzimi (Schema 8).
La generazione razionale di un'ipotesi di farmacoforo comune appare attualmente come la tecnica più consolidata per identificare frammenti multitarget. Prati et al. hanno applicato un tale approccio per lo sviluppo di inibitori duali BACE-1/GSK-3β [30]. Gli autori sono partiti dalle ipotesi che un'ammide ciclica è cruciale per l'inibizione di GSK-3β, mentre una guanidina è necessaria per inibire BACE-1. Questa logica ha portato alla combinazione di entrambi i motivi strutturali nel frammento triazinonico 12 con attività inibitoria duale. Tuttavia il successivo studio SAR del frammento iniziale non è riuscito a migliorare significativamente la potenza inibitoria. Shang et al. [31] hanno progettato razionalmente frammenti per il doppio targeting di COX-2 e leucotriene A4 idrolasi (LTA4H) analizzando ligandi selettivi per entrambi i bersagli, identificando 9 frammenti su 21 che presentavano una doppia attività inibitoria alla concentrazione 1 μM. La crescita di frammenti structure-based ha poi consentito l'ottimizzazione della potenza di un frammento in un intervallo micromolare.
Gli autori degli studi sopra descritti affermano che la scoperta fragment-based di farmaci multitarget è un approccio promettente, ma i risultati mostrano semplicemente che la sua implementazione pratica è ancora piuttosto immatura. La progettazione fragment-based per singoli target è già ben avviata, ma non è lo stesso per la progettazione di farmaci multitarget, in quanto al momento sono descritti solo pochi studi in cui si applica uno screening completo delle librerie fragment-based verso una combinazione di target razionalmente selezionata.
Artis et al. hanno descritto la scoperta fragment-based dell'agonista pan-PPAR indeglitazar 13 [32] a partire dal frammento multitarget acido 5-metossiindole-3- propionico 13a, che è stato identificato tra gli altri in una libreria di frammenti mediante saggi in vitro. Sono state quindi generate strutture a raggi X di 13a con tutti e tre i sottotipi di PPAR per definire un'ipotesi razionale di ottimizzazione ed
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infine consentire lo sviluppo di 13. In tal modo, la scoperta di 13 evidenzia i principali svantaggi degli approcci fragment-based attuali verso l’identificazione di multitarget: sembra possibile identificare i frammenti hit che si rivolgono a targeting multipli, ma sono poi necessarie informazioni strutturali, perché la crescita di frammenti e la progettazione fragment-based abbiano successo. Tuttavia pochi laboratori che lavorano in questo campo hanno la possibilità di produrre informazioni strutturali affidabili. Numerosi approcci alla progettazione multitarget fragment-based hanno cercato di superare questo problema mediante il docking molecolare, ma la maggior parte di questi tentativi non è riuscita ad ottenere un significativo miglioramento dell'attività; ciò potrebbe essere dovuto al limitato potere predittivo degli algoritmi comunemente utilizzati. I recenti progressi nelle tecniche cristallografiche ad alta risoluzione possono consentire un importante passo avanti nella scoperta di farmaci multitarget fragment-based in un prossimo futuro.
Un'altra importante applicazione del design fragment-based è lo sviluppo di inibitori multichinasici. Inizialmente la selettività, più che l'attività multitarget, è stata uno dei problemi dominanti nel design di un inibitore chinasico ortosterico, che imiti l'ATP. Tuttavia la maggior parte degli inibitori della chinasi approvati non sono selettivi per un singolo target, ma possiedono attività su un piccolo sottogruppo del chinoma. Nonostante siano progettati come agenti selettivi, gli inibitori della chinasi devono spesso la loro efficacia terapeutica a questi profili polifarmacologici. La recente comprensione dell’insorgenza dei fenomeni di resistenza delle cellule cancerose nei confronti degli inibitori della chinasi, ha modificato il paradigma della selettività ed ha incoraggiato il design di inibitori delle chinasi polifarmacologici. In ciò, il concetto di frammenti privilegiati dalla chinasi facilita l’identificazione dei lead per gli inibitori multichinasici. Frett et al. hanno applicato con successo questo approccio identificando un inibitore duale della chinasi riarrangiata durante la transfezione (RET) e del recettore, tipo 2, del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFR2) [33]. Un composto lead è stato selezionato mediante screening di una libreria di frammenti attivi sulle chinasi. Le interazioni lipofile con i target ed il
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profilo PK sono stati successivamente ottimizzati per ottenere un candidato clinico con il profilo polifarmacologico desiderato.
Una sfida peculiare nel processo di progettazione di inibitori multichinasici è il bilanciamento della potenza sulle chinasi target desiderate e sulle chinasi off-target indesiderate. La combinazione di un modello fenotipico di Drosophila di neoplasia endocrina multipla di tipo 2 e la determinazione del profilo di attività su un ampio numero di chinasi ha risolto con successo questo problema. Il doppio approccio di screening ha consentito di identificare in modo efficace i candidati multitarget da una libreria di composti privilegiati con un bilancio favorevole tra efficacia e tossicità.
Schema 8. Esempi di frammenti multitarget [1]
Il doppio inibitore della β-secretasi 1 (BACE-1) e della glicogeno sintasi-chinasi 3β (GSK- 3β) (11) è stato identificato in maniera computazionale sulla base dell'ipotesi della presenza comune nei due target di gruppi capaci di formare legame H e confermato come inibitore di entrambi gli enzimi mediante screening funzionale basato su NMR. Il triazinone (12) è stato progettato razionalmente come doppio inibitore di BACE-1 e GSK-3β combinando i motivi strutturali richiesti per l'interazione con i due enzimi. Il farmaco approvato indeglitazar (13) che attiva i recettori nucleari PPARα, PPARγ e PPARδ è stato sviluppato dal frammento 13a che era stato identificato come attivo sui tre recettori in uno screening di una libreria di frammenti. L'ottimizzazione strutturale è stata effettuata sulla base dei dati della struttura co-cristallina di 13a con tutti e tre i PPAR.
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