Modelli di farmacoforo

L’elaborazione dei modelli farmacoforici fornisce la possibilità di un approccio computazionale complementare agli approcci basati sui descrittori sopra citati, per l'identificazione di ligandi multipli. I modelli di farmacoforo che descrivono “l'insieme di caratteristiche steriche ed elettroniche di un composto che è necessario per l'interazione con un bersaglio biologico” possono essere dedotti computazionalmente da un insieme di ligandi noti per quel determinato target (basati sul ligando, ligand-based) o da strutture co-cristalline (basate sulla struttura, structure-based). Rappresentano una disposizione tridimensionale di caratteristiche come gruppi donatori/accettori di legami idrogeno, residui carichi, interazioni aromatiche o contatti lipofili. Inoltre in questi modelli tridimensionali si possono definire volumi di esclusione per evitare collisioni con il target biologico, che porterebbero a composti inattivi anche se questi possiedono tutte le caratteristiche farmacoforiche positive.

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I modelli farmacoforici ligand-based sono generati sulla base di un set di composti noti attivi per un target di interesse. I composti attivi noti sono allineati al fine di identificare le caratteristiche farmacoforiche comuni da includere nel modello di farmacoforo. Poiché le conformazioni bioattive di questi ligandi non possono essere note senza informazioni strutturali, è necessario includere un numero di conformazioni preferenziali ad energia minimizzata per ogni ligando; ciò può richiedere notevoli tempi di calcolo. Tuttavia i moderni algoritmi dei software di modellazione del farmacoforo sono adatti per coprire lo spazio conformazionale tridimensionale di piccole molecole. Oltre al campionamento delle conformazioni preferibili dei ligandi, il loro allineamento è un elaborato compito computazionale. Ad esempio, le piccole molecole possono essere allineate sovrapponendo singoli atomi, gruppi di atomi (frammenti) o caratteristiche chimico/farmacoforiche secondo il concetto dei minimi quadrati; sono disponibili anche metodi basati su descrittori e le moderne tecniche di allineamento utilizzano, ad esempio, il riconoscimento della forma strutturale generale. Questo gran numero di fattori, che influenza la generazione del modello di farmacoforo oltre alla selezione del set di ligandi, può portare a notevoli variazioni nei modelli finali e, quindi, la modellazione del farmacoforo ligand-based è un compito impegnativo anche se si considera un singolo target.

La generazione di modelli farmacoforici structure-based offre il grande vantaggio che la conformazione tridimensionale ottimale del ligando può essere estratta dalla struttura co-cristallina. Inoltre le caratteristiche del farmacoforo possono essere definite dalle interazioni del ligando con il target biologico ed i volumi esclusi risultano dalla superficie del sito di legame. Tuttavia i modelli di farmacoforo structure-based derivati da una singola struttura co-cristallina non possono coprire l'intero spazio chimico di piccole molecole che potrebbero interagire con il target di interesse. Una struttura co-cristallina rappresenta solo una possibile conformazione "congelata" della proteina e, quindi, un modello farmacoforico structure-based non è capace di rappresentare l'adattamento conformazionale dovuto all’interazione con il ligando.

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Entrambi i modelli di farmacoforo, ligand-based e structure-based, hanno i loro limiti e spesso producono alti tassi di falsi positivi negli approcci di screening, portando all’identificazione di pochi composti attivi. Tra i fattori sfavorevoli ai processi di screening basati sui farmacofori vi sono una scarsa qualità dei dati, un numero limitato di composti inattivi noti, strutture cristalline errate ed un'implementazione computazionale limitata di alcuni tipi di interazione come il legame degli alogeni. Per ottimizzare l'output ad una percentuale massima di composti hit realmente attivi, i modelli di farmacoforo devono essere attentamente definiti e validati in modo incrociato se sono disponibili dati sufficienti. Sebbene i modelli farmacoforici siano spesso superati in termini di performance da approcci basati su descrittori quando si tratta di singoli target, essi rappresentano un valido approccio nel processo di identificazione di ligandi multipli.

Le strategie per ottenere ligandi multipli mediante l’ausilio dei modelli farmacoforici prevedono lo screening virtuale di librerie di composti per identificare potenziali ligandi o la progettazione de novo di piccole molecole che fittano con i modelli di farmacoforo. Per la scoperta di ligandi multipli mediante screening virtuale basato sul farmacoforo, sono necessari due screening individuali utilizzando i modelli farmacoforici di entrambi i target di interesse. In uno scenario ottimale, le librerie di composti analizzate contengono un set di conformazioni preferite ad energia minimizzata per ciascuna struttura in modo da identificare le conformazioni che fittano il modello farmacoforico, sebbene questo processo determini un aumento significativo del tempo di calcolo. È necessario definire un limite di tolleranza adeguato per tutti i singoli requisiti farmacoforici che devono essere fittati dai composti screenati, mentre alcuni requisiti potrebbero eventualmente essere definiti come opzionali. I composti che fittano i farmacofori di entrambi i target di interesse devono poi essere analizzati in modo più dettagliato, usando ad esempio il docking molecolare per validarli ulteriormente tramite simulazioni in silico, prima di essere testati sperimentalmente. In alcuni studi, seguendo questa strategia, si sono generati modelli di farmacoforo per i siti di legame dei ligandi di entrambi i target di interesse, e quindi si sono screenate librerie

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di composti per individuare strutture che fittano entrambi i modelli di farmacoforo. Queste molecole sono state poi dockate nei siti di legame di entrambi i target e quelle che sono risultate più promettenti sono state validate sperimentalmente con buoni tassi di successo.

In alternativa, possono anche essere sviluppati modelli farmacoforici che includono le caratteristiche farmacoforiche comuni di entrambi i target di interesse. Tali modelli, detti consensus model, possono derivare da informazioni strutturali di co- cristalli di ciascun target, da ligandi duali noti di entrambi i target o da una combinazione di entrambi. Un modello esemplare di doppio consensus model è stato costruito dockando ligandi duali noti nelle strutture di entrambi i target per identificare gli elementi farmacoforici comuni, che sono stati quindi utilizzati per definire i motivi comuni del modello.

Un approccio basato su farmacoforo duale ligand-based puro ha consentito di costruire modelli farmacoforici per gruppi di inibitori dell'epossido idrolasi in forma solubile (sEH) e della 5-lipossigenasi (5-LO). Successivamente, i modelli sono stati allineati a coppie per produrre modelli di farmacoforo duale. È importante sottolineare che l'allineamento ha permesso di variare le distanze tra le singole caratteristiche farmacoforiche in base al presupposto che i target possano condividere i ligandi a causa di elementi farmacoforici condivisi anche se questi elementi hanno distanze spaziali distinte. Lo screening virtuale pharmacophore-based, seguito da analisi degli scaffold ed una rifinitura delle caratteristiche dimensionali ed elettrostatiche, ha consentito l’identificazione di un nuovo inibitore duale (7) di sEH e 5-LO, con doppia potenza intermedia (Figura 1).

Il design de novo pharmacophore-based come strategia alternativa per ottenere piccole molecole attive dai modelli farmacoforici presenta il grande vantaggio che consente lo sviluppo di nuove entità chimiche piuttosto che l’identificazione di ligandi da librerie di composti noti. Sono state sviluppate numerose tecniche per "inventare" computazionalmente tali nuovi composti, inclusi approcci basati su reazioni che fondono unità strutturali semplici (building blocks), fusione di frammenti strutturali, ed applicazioni dell’intelligenza artificiale generativa. In tutti i casi, la progettazione

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de novo viene poi valutata usando modelli di farmacoforo per i target di interesse o un modello di consensus pharmacophore per selezionare i composti più promettenti da avviare a sintesi e successiva valutazione biologica. Lo svantaggio di questo approccio potrebbe essere la difficoltà sintetica dei composti progettati de novo.

Figura 1. Un approccio a farmacoforo duale ligand-based ha generato modelli di farmacoforo per inibitori dell'epossido idrolasi in forma solubile ed inibitori della 5-lipossigenasi.

Il successivo allineamento ha prodotto un farmacoforo duale (consensus pharmacophore) che, applicato in uno screening virtuale, ha consentito di identificare un nuovo inibitore duale (7) di entrambi gli enzimi [1]

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3.3.1.4. Identificazione di ligandi con targeting multiplo mediante