A Me Stessa
A questo Traguardo
All’Avverarsi di un Grande Sogno
UNIVERSITÀ DI PISA
DIPARTIMENTO DI FARMACIA
Corso di Laurea Magistrale in Farmacia
Tesi di Laurea
BASI RAZIONALI PER LA PROGETTAZIONE DI
FARMACI POLIFARMACOLOGICI: LA PROSPETTIVA
DI UN CHIMICO FARMACEUTICO SUI COMPOSTI
MULTITARGET
Relatore:
Prof.ssa Sabrina Taliani
Candidato:
Giulia Marzocchi
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Indice
1. Introduzione ________________________________________ 3
1.1. Storia della scoperta dei farmaci multitarget: dai "Farmaci sporchi"
ai ligandi a targeting multiplo _________________________________ 3
1.2. Vantaggi dei farmaci multitarget ___________________________ 4
1.3. Aree di applicabilità ______________________________________ 5
2. Identificazione di combinazioni di target adatti per lo sviluppo
di ligandi multitarget ___________________________________ 8
2.1. Selezione razionale del target basata su osservazioni cliniche __ 9
2.2. Screening fenotipico delle combinazioni di farmaci __________ 11
2.3. Approcci in Silico alle combinazioni target: biologia dei
sistemi/farmacologia ________________________________________ 13
3. Identificazione ed ottimizzazione dei ligandi a targeting
multiplo _____________________________________________ 16
3.1. Serendipity ____________________________________________ 16
3.2. Farmacofori collegati mediante linker _____________________ 19
3.2.1. Esempi di farmacofori collegati ____________________ 19
3.2.2. Chimica dei linker _______________________________ 22
3.2.3. Ligandi fusi a targeting multiplo __________________ 23
3.3. Ligandi unificati a targeting multiplo ______________________ 24
3.3.1. Strategie di identificazione dei composti lead per lo
sviluppo di ligandi multipli unificati ____________________ 25
3.3.1.1. Approcci razionali _______________________ 25
3.3.1.2. Approcci computazionali basati su descrittori 28
3.3.1.3. Modelli di farmacoforo ___________________ 29
3.3.1.4. Identificazione di ligandi con targeting multiplo
mediante osservazioni cliniche ___________________ 34
3.3.2. Strategie di ottimizzazione per ligandi multipli combinati
____________________________________________________ 36
3.3.3. Approccio design-in _____________________________ 39
3.3.4. Approccio design-out ____________________________ 40
3.4. Approcci basati su frammenti (fragment-based) per ligandi a
targeting multiplo __________________________________________ 41
2
4. Sistemi di test per caratterizzare ligandi multipli ________ 45
4.1. Sistemi per i saggi cellulari _______________________________ 45
4.2. Modelli animali _________________________________________ 47
5. Conclusioni e prospettive ____________________________ 49
Esempi di alcuni farmaci multitarget utilizzati in clinica approvati
dalla FDA ____________________________________________ 53
1.
Sunitinib (Sutent®) _________________________________________ 55
2.
Sorafenib (Nexavar®) _______________________________________ 56
3.
Vandetanib (Caprelsa®) _____________________________________ 57
4.
Olaparib (Lynparza®) ______________________________________ 58
5.
Pazopanib (Votrient®) ______________________________________ 59
6.
Temsirolimus (Torisel®) _____________________________________ 60
7.
Bevacizumab (Avastin®) ____________________________________ 61
8.
Everolimus (Afinitor®) ______________________________________ 61
9.
Axitinib (Inlyta®) __________________________________________ 63
10.
Cabozantinib (Cabometyx®) _________________________________ 64
11.
Cabozantinib (Cometriq®) ___________________________________ 65
Bibliografia __________________________________________ 66
Ringraziamenti _______________________________________ 71
3
1. Introduzione
1.1. Storia della scoperta dei farmaci multitarget: dai "Farmaci sporchi" ai
ligandi a targeting multiplo
L'alta efficacia terapeutica di alcuni dei nostri farmaci più storici è da attribuirsi alle loro attività pleiotropiche su molteplici bersagli. Piccole molecole note da tempo come l'acido acetilsalicilico, il paracetamolo e la metformina interagiscono con una varietà di proteine, portando a profili di attività che causano effetti modulatori sinergici in vie di segnalazione o cascate enzimatiche complementari. Dalla somma di numerosi effetti farmacodinamici origina il loro, spesso superiore, profilo di attività clinica. Lo stesso vale per i nuovi farmaci come le statine che, ad esempio, mostrano effetti anti-infiammatori, che supportano il loro profilo di efficacia clinica, ma che sembrano non essere mediati dal loro principale target d'azione. Sebbene non siano mai state progettate, queste molteplici attività spesso sono responsabili dell'auspicabile efficacia complessiva di un farmaco. Per molto tempo, il profilo di attività multitarget capace di produrre un'efficacia additiva, o anche sinergica, è stato identificato per serendipity (per molti farmaci non tutte le attività conosciute possono essere collegate ad un target biologico); la ricerca moderna cerca invece di progettare intenzionalmente e razionalmente piccole molecole con attività multitarget ben definite [1].
A partire dal 2004, Morphy, Rankovic ed altri hanno classificato in modo sistematico gli agenti multitarget ed analizzato le strategie utilizzate per lo sviluppo di un gran numero di ligandi [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8]. Da allora, i farmaci multitarget hanno registrato un interesse in costante crescita, soprattutto a causa dei potenziali vantaggi correlati ad un loro futuro utilizzo in terapia. Lo sviluppo dei composti multitarget, nonché le strategie e le tecnologie per la loro progettazione sono stati ripetutamente rivisti. Attualmente, i disturbi neurodegenerativi e psichiatrici, le malattie infettive, il cancro e le malattie metaboliche/cardiovascolari rappresentano i principali ambiti in cui si cerca di sviluppare dei farmaci multitarget, proprio a causa della loro natura multifattoriale o della frequente insorgenza di resistenza
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terapeutica. Il trattamento di queste malattie può beneficiare fortemente di attività farmacodinamiche molteplici, additive o sinergiche in termini di maggiore efficacia terapeutica o di ritardo nello sviluppo di fenomeni di resistenza. Inoltre sta acquisendo sempre più importanza il delivery mirato, che sfrutta l'affinità di una piccola molecola/ligando di riferimento per uno specifico target biologico, consentendo la distribuzione selettiva di potenti agenti legati al ligando di riferimento a livello dei tessuti o persino delle cellule malate.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è quello di valutare il significato scientifico del design multitarget nell'attuale ricerca in chimica farmaceutica e dare una visione degli strumenti disponibili per la progettazione di piccole molecole multitarget. Nello specifico, si analizzano le strategie e le tecnologie utili per sviluppare ligandi multipli attraverso un approccio razionale, al fine ultimo di identificare nuovi farmaci multitarget.
1.2. Vantaggi dei farmaci multitarget
Molte malattie, come ad esempio lo squilibrio metabolico che culmina nella sindrome metabolica, i disturbi psichiatrici o degenerativi del SNC o il cancro, hanno una natura multifattoriale che difficilmente può essere "curata" dalla modulazione specifica di un singolo target. I processi multifattoriali che portano alla neurodegenerazione, allo sviluppo del cancro, alla proliferazione ed alle metastasi o alla manifestazione del diabete e di altre malattie metaboliche coinvolgono molteplici vie di segnalazione e la disregolazione di più processi fisiologici. Il trattamento di queste malattie richiede quindi la modulazione di molteplici target biologici per ripristinare l'equilibrio fisiologico con una sufficiente efficacia terapeutica. Ciò è ottenuto mediante terapie combinate costituite da diversi farmaci specifici per un singolo target (politerapia) o usando farmaci multitarget capaci di modulare l’attività di un certo numero di target biologici, producendo effetti additivi o sinergici (polifarmacologia). I fallimenti, che si sono susseguiti nello sviluppo clinico di farmaci altamente potenti e specifici per un singolo target e la loro limitata efficacia terapeutica, hanno incoraggiato la progettazione di composti multitarget.
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Infatti i farmaci multitarget offrono una varietà di vantaggi. Ligandi multipli ben progettati e bilanciati in modo ottimale possono sostituire una serie di farmaci in una terapia di combinazione e quindi ridurre notevolmente la politerapia. Con la conseguente riduzione della complessità del trattamento, è possibile ridurre gli effetti collaterali dei farmaci, la complessità farmacocinetica e le interazioni farmaco-farmaco. Inoltre la modulazione dell’attività di più bersagli biologici può aumentare l'efficacia terapeutica per effetto sinergico. La combinazione di appropriati target può consentire l'applicazione di dosi di farmaco più basse, pur mantenendo adeguati effetti terapeutici, poiché la modulazione parziale di target ad azione sinergica può essere sufficiente per raggiungere la piena efficacia terapeutica. Questo, a sua volta, può ridurre gli effetti collaterali mediati dalla modulazione totale dei singoli target senza perdere efficacia terapeutica e può ampliare la finestra terapeutica. Infine la scoperta di farmaci multitarget offre anche vantaggi economici poiché lo sviluppo clinico di un singolo farmaco multitarget richiede meno studi clinici rispetto a quello relativo a più farmaci target-selettivi [1].
1.3. Aree di applicabilità
L’idea che sta alla base dello sviluppo dei composti multitarget è che la modulazione contemporanea di targeting multipli sia capace di produrre effetti additivi o sinergici. Sono stati così studiati ligandi multipli in numerosi ambiti di ricerca in chimica farmaceutica. Questi possiedono un enorme potenziale terapeutico, ad esempio, grazie a combinazioni target-sinergiche antibatteriche o antitumorali che potrebbero aiutare ad evitare lo sviluppo della resistenza agli antibiotici o alla chemioterapia, che rappresentano sfide globali dell'attuale ricerca di nuovi farmaci. Inoltre le malattie multifattoriali che coinvolgono la disregolazione di diverse funzioni fisiologiche, come i disturbi neurologici o la sindrome metabolica, possono beneficiare notevolmente di composti multitarget in cui sono combinate molteplici adeguate modalità d'azione.
D’altro canto, i ligandi multipli possono essere progettati anche per interagire con più siti di legame su di uno stesso target, e quindi esibire contemporaneamente
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attività di modulazione allosterica ed ortosterica. Questa tipologia di composti, ad esempio, si ritrova nel campo dei recettori accoppiati con proteine G (GPCR), dove lo sviluppo di ligandi bitopici costituisce una strategia promettente per raggiungere un’elevata selettività verso uno specifico target e, nonostante la similarità dei siti di legame ortosterico, potrebbe offrire un modo per modulare specificatamente la funzione GPCR.
Un altro ambito correlato allo sviluppo di ligandi multipli è il delivery mirato, nel quale vengono progettati dei coniugati farmacologici nei quali una molecola target è legata ad un potente agente farmacologicamente attivo che viene così trasportato al sito d'azione previsto proprio con l'aiuto del ligando-target (cfr. Sezione 3.2). I coniugati farmacologici per la terapia del cancro sono spesso composti da un anticorpo monoclonale e da un potente agente citotossico, seppur recentemente anche le piccole molecole vengono sempre più impiegate come ligandi target. I coniugati farmacologici si distinguono dai ligandi multipli in quanto i farmacofori relativi ai vari target non sono uniti in un’unica struttura (cfr. Sezione 3, Schema 1). Nel contesto dell'idea di base secondo la quale i ligandi multitarget sono quei ligandi capaci di esibire effetti farmacodinamici su più target biologici, in pratica ogni combinazione di target è pensabile. Più diversi sono i target in termini di chemiotipo dei relativi ligandi, più difficile è lo sviluppo di composti capaci di modulare l’attività di questa combinazione di target. Pertanto la maggior parte dei composti multitarget è progettata razionalmente per interagire con combinazioni di target che derivano da una stessa famiglia di proteine, come chinasi o GPCR, oppure per modulare targeting multipli che sono coinvolti in uno stesso percorso enzimatico, come la cascata dell’acido arachidonico in cui i diversi enzimi agiscono su substrati strutturalmente simili. Tuttavia esempi di sviluppo di ligandi multipli per target biologici marcatamente diversi dimostrano che sono approcciabili anche combinazioni di target molto più complesse in termini di progettazione di composti multitarget.
Una chiave per il successo del design di un composto multitarget è la selezione di combinazioni di target che possano produrre effetti additivi o persino sinergici.
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Inoltre i target devono essere compatibili in termini di accomodamento dei ligandi e localizzazione cellulare/tissutale per consentire lo sviluppo di ligandi a targeting multiplo che siano efficaci e che abbiano caratteristiche drug-like. Va sottolineato, infatti, che una localizzazione dei target in diversi compartimenti cellulari o tissutali comporta un ulteriore livello di complessità negli aspetti farmacodinamici, farmacocinetici ed anche tossicologici, nell’ambito già complesso della ricerca volta allo sviluppo di nuovi farmaci [1].
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2. Identificazione di combinazioni di target adatti per lo
sviluppo di ligandi multitarget
Come affermato in precedenza, uno dei problemi centrali nella selezione dei target per lo sviluppo di farmaci con targeting multipli è la fattibilità chimica del ligando multitarget stesso. È intuitivo che progettare un ligando a doppio target sia più facile quando i target sono altamente correlati, come esemplificato dai ligandi multitarget progettati per i recettori amminergici o per le chinasi. Più impegnativo è il processo di progettazione di ligandi multipli capaci di interagire con target non correlati. In questo caso, la probabilità di successo nello sviluppo di un ligando multiplo dipende dalla capacità di questi target non correlati di ospitare composti chimicamente correlati; un esempio è il design di 62 ligandi multipli capaci di inibire la cicloossigenasi-2 (COX-2) ed antagonizzare il recettore del trombossano [9]. Sebbene i due target siano fortemente diversi, i loro ligandi acido arachidonico e trombossano A2 sono strutturalmente correlati, suggerendo che i siti di legame possiedono un certo grado di somiglianza e potrebbero ospitare lo stesso ligando. Una sfida ancora più difficoltosa consiste nella progettazione di ligandi multitarget per target non correlati che ospitano ligandi strutturalmente non correlati. Tuttavia ci sono diversi esempi che dimostrano che è possibile anche la progettazione di tali ligandi. Ciceri et al. ad esempio, hanno descritto inibitori duali della chinasi/bromodominio 4 competitivi per ATP, l'ultimo dei quali riconosce lisine acetilate [10]. Inoltre l'antagonista del recettore 1 (AT1R) dell'angiotensina II, il telmisartan (un peptidomimetico), si lega anche al recettore gamma del proliferatore perossisomiale (PPARγ), che agisce come recettore degli acidi grassi e dei rispettivi mimetici, consentendo così la scoperta di composti duali, antagonisti AT1R/modulatori PPARγ con notevole attività in vivo [11] [12].
Sebbene le determinanti della fattibilità teorica delle combinazioni di target per lo sviluppo di ligandi multipli non siano state studiate in modo sistematico, sono disponibili molti metodi utilizzabili per questo scopo. La maggior parte di essi si basa sul principio di somiglianza chimica postulato da Johnson e Maggiora [13].
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Sebbene questo principio non possa essere definito generale in senso assoluto, una moltitudine di studi ha dimostrato la sua applicabilità nel prevedere la polifarmacologia e definire relazioni tra target distinti in base alla somiglianza chimica dei loro ligandi corrispondenti.
2.1. Selezione razionale del target basata su osservazioni cliniche
La non soddisfacente efficacia delle opzioni terapeutiche disponibili per molte malattie ha promosso l'uso di combinazioni di farmaci rivolti a target distinti. In molti casi, le esigenze mediche hanno portato ad un approccio terapeutico iniziale consistente in un mix di farmaci diversi, anziché in combinazioni target sinergiche realizzate in una singola molecola. In ogni caso, differenze nelle proprietà farmacocinetiche come l'emivita, la distribuzione e le interazioni farmaco-farmaco rendono problematiche le formulazioni di combinazioni di farmaci per molti pazienti e, pertanto, la loro applicabilità è spesso limitata. Tuttavia la conoscenza della maggiore efficacia terapeutica di tali combinazioni di farmaci, nonostante i loro ovvi inconvenienti, ha promosso lo sviluppo razionale degli agenti multitarget per combinazioni di target precedentemente convalidate dall’impiego di mix di farmaci. La crescente conoscenza dei biomarcatori e la loro accessibilità analitica hanno poi aperto ulteriori strade per verificare clinicamente gli approcci multitarget con idonei mix di farmaci, anche per le malattie orfane.
Un primo esempio relativo allo sviluppo di farmaci multitarget basati su osservazioni cliniche riguarda gli antipsicotici. L'approccio terapeutico iniziale di inibire i recettori D2-like della dopamina come target primario (derivato da antagonisti del recettore dell'istamina H1 di prima generazione precoce) era stato
associato a notevoli effetti collaterali come i sintomi motori extrapiramidali. La successiva inclusione dell'attività 5-HT2A anti-serotoninergica ha migliorato
significativamente l'efficacia terapeutica e ridotto gli effetti negativi. Successivamente, la possibilità di ottenere una modulazione di efficacia su diversi target biologici, come un agonismo parziale su un recettore ed un agonismo inverso su un altro, ha consentito di sviluppare composti dotati di selettività funzionale su
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più recettori. Questo design multitarget razionale e guidato dall'osservazione clinica ha consentito di ridurre gli effetti collaterali ed aumentare i tassi di risposta del paziente, come esemplificato con farmaci antipsicotici atipici di successo come aripiprazolo o cariprazina (RGH188).
Oltre al design di ligandi multipli basato sull’efficacia clinica e sulla sicurezza, l’osservazione degli effetti clinici dei farmaci polifarmacologici ha portato alla loro riproposizione o riposizionamento (repurposing)per diverse indicazioni terapeutiche (cfr. Sezione 3.3.1.4). Inoltre l'efficacia imprevista o superiore dei farmaci comprendenti profili polifarmacologici ha suggerito profili multitarget favorevoli e consentito una selezione razionale dei target per future combinazioni. Ciò è ulteriormente supportato dall'aumento della conoscenza clinica relativa alle cause sottostanti di una malattia, nonché della comprensione delle vie di segnalazione disregolate. L’individuazione di target molecolari adeguati mediante l'osservazione clinica dell'efficacia terapeutica, consente una progettazione razionale di profili polifarmacologici favorevoli. Approcci basati su frammenti strutturali (fragment-based) (cfr. Sezione 3.4) e su requisiti farmacoforici (pharmacophore-(fragment-based) (cfr. Sezione 3.3.1.3), possono consentire l’identificazione di farmaci (o altre piccole molecole bioattive) con un'adeguata somiglianza strutturale quali composti lead da sottoporre ad un processo di ottimizzazione al fine di ottenere il profilo multitarget desiderato verso combinazioni target validate clinicamente.
Target correlati che comprendono siti di legame simili come diversi GPCR amminergici di classe A, chinasi o recettori nucleari si prestano bene a tali approcci multitarget, ma possono anche essere fonte di reattività incrociata off-target che determina la comparsa di effetti avversi. In tali casi, diventa impossibile distinguere la promiscuità di target razionalmente progettata dalla reattività incrociata che si verifica per serendipity. La progettazione di combinazione di target diversi come GPCR di membrana, trasportatori transmembrana ed enzimi intracellulari localizzati in diverse parti dell'architettura cellulare o target nucleari rappresenta una sfida molto più impegnativa. Tuttavia diversi esempi evidenziano la possibilità di progettare ligandi multipli per combinazioni di target pianificate razionalmente
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con potenziale applicazione nei disturbi psichiatrici e del SNC e nelle malattie metaboliche ed infiammatorie, ma anche per lo sviluppo di farmaci oncologici o antimicrobici per i quali l’insorgenza di fenomeni di resistenza determina un’urgente necessità di interventi multifattoriali. Ad esempio, l'attività su tre target cognitivi validati clinicamente, vale a dire l'autorecettore presinaptico H3
dell'istamina, Nτ-metiltransferasi ed acetil- e butirrilcolinesterasi, potrebbe essere unita in singoli agenti multitarget nonostante i problemi di farmacocinetica e la penetrazione limitata nel cervello [1].
2.2. Screening fenotipico delle combinazioni di farmaci
Sonde chimiche e ligandi ben caratterizzati con alta selettività nei confronti di target correlati, rappresentano strumenti utili per identificare combinazioni di target che producono effetti sinergici. Tuttavia valutare gli effetti sinergici derivanti da due o anche più target in modelli di malattie complesse negli animali è tutt’altro che agevole. È necessario infatti un numero elevato di animali a causa dell'elevato numero di combinazioni target putativo/composto, combinazioni che crescono esponenzialmente con il numero di sonde impiegate, e questo è eticamente intollerabile. Anche utilizzando un numero limitato di sonde chimiche, potrebbero comunque essere necessarie diverse combinazioni di dosi, portando ugualmente ad un numero elevato di esperimenti sugli animali. Il knockout genetico o il knockdown di uno dei target combinati (possibilmente pre-validato) con l'uso di sonde chimiche rappresenta un approccio prezioso per ridurre il numero di animali necessari negli screening per combinazioni di target sinergici. Uno studio esemplificativo è quello in cui si è impiegato il diclofenac, inibitore della COX, in modelli infiammatori di topi FAAH (-/-), al fine di convalidare la sinergia tra i target COX e FAAH. Tuttavia le sonde chimiche sono spesso scarsamente caratterizzate in vivo ed una farmacocinetica inappropriata può causare falsi risultati negativi. Pertanto i modelli cellulari, tissutali o di animali non mammiferi sembrano più adatti per lo studio di un gran numero di combinazioni di composti, con lo scopo di identificare target sinergici. Tali sistemi di analisi di solito si basano sulla valutazione di processi
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funzionali come l'apoptosi (specialmente nelle cellule tumorali), l'ingresso virale (nelle malattie virali) o la morte batterica (nelle malattie infettive). Soprattutto nel campo della scoperta di farmaci antitumorali, dove sono richieste potenti terapie di combinazione, gli screening delle combinazioni di farmaci hanno aiutato ad identificare diverse sinergie derivanti da combinazioni di target. Un esempio recente è rappresentato dallo studio nel quale si sono analizzati mix di composti efficaci nelle neoplasie ematologiche mieloidi e linfoidi. I campioni primari derivanti da 122 pazienti con varie neoplasie ematologiche sono stati profilati ex vivo contro un pannello di 48 combinazioni di farmaci, portando alla scoperta dell'attività sinergica dell'inibitore del linfoma a cellule B (BCL2) venetoclax e dell'inibitore della proteina chinasi (MEK) attivato dal mitogeno cobimetinib, dell’idasanutlin, inibitore della proteina MDM2 o dell’inibitore del dominio extra-terminale del bromo (BET), ABBV-075. Tali suggerimenti per opportune combinazioni di farmaci possono essere successivamente validati, ad esempio, utilizzando il silenziamento genico CRISPR/Cas9 e con esperimenti in vivo, per fornire punti di partenza ideali e validati per una campagna di scoperta di farmaci multitarget.
I saggi biologici che si basano su complesse letture multidimensionali vengono spesso definiti screening ad alto contenuto (high-content screening) o screening fenotipico (phenotypic screening) quando vengono utilizzati interi organismi. Tali sistemi di screening rappresentano uno step inevitabile nel processo di scoperta di farmaci ed hanno un valore particolarmente elevato per la progettazione multitarget. I BioMAP sono sistemi di high-content screening ben consolidati. Le colture BioMAP sono costituite da cellule umane primarie a basso passaggio che forniscono risposte fisiologiche in seguito all'esposizione ad agenti farmacologici. Un altro potente sistema di high-content screening è costituito dalle cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC), che possono essere convertite in vari tipi di cellule adatte allo high-content screening di sonde chimiche e di loro combinazioni.
Sistemi di screening più sofisticati impiegano interi organismi come la mosca della frutta, Drosophila melanogaster, o il pesce zebra, Danio rerio. I saggi basati su questi organismi consentono letture complesse, compresi anche cambiamenti
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comportamentali che possono essere impiegati per lo screening di combinazioni target sinergiche nei disturbi correlati al SNC. Ad esempio, il gruppo di Sonoshita et al. ha usato un modello di carcinoma tiroideo midollare (MTC) della Drosophila per migliorare il profilo di efficacia e sicurezza dell'inibitore multichinasico sorafenib [14].
2.3. Approcci in Silico alle combinazioni target: biologia dei
sistemi/farmacologia
È possibile identificare combinazioni appropriate di target anche con tecniche in silico. Soprattutto l'approccio di farmacologia di rete (network pharmacology) basato sull'analisi di reti di target biologici è stato impiegato con successo per identificare combinazioni promettenti di target. È disponibile un ampio panel di metodi in silico quali strumenti utili per suggerire combinazioni sinergiche di farmaci secondo questa strategia, come ad esempio l'analisi della rete dei signalling coinvolti nel processo di apprendimento. In particolare, questi approcci computazionali forniscono solo ipotesi che successivamente necessitano di validazione in vitro o in vivo in relazione alle combinazioni di target suggerite come adatte e favorevoli. La Tabella 1 offre una panoramica delle tecniche computazionali proposte per la previsione di combinazioni promettenti di target e farmaci. Da notare che molti di questi approcci non sono stati validati sperimentalmente per la progettazione multitarget.
Studi che hanno avuto successo nell’identificazione di combinazioni sinergiche di target sono in generale basati su una combinazione di tecniche sperimentali e computazionali; ad esempio, la combinazione di un test fenotipico sui neuroni primari del SNC con algoritmi di apprendimento automatico per la deconvoluzione degli effetti mediati dai composti, ha portato all'identificazione di combinazioni di target che promuovono la crescita degli assoni. Inoltre uno screening farmacologico combinatoriale nelle cellule dedifferenziate di liposarcoma (DDL), seguito da modellizzazione computazionale delle reti di segnalazione sottostanti, ha consentito di identificare la ciclina dipendente chinasi 4 (CDK4) ed il recettore del fattore di
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crescita simile all'insulina 1 (IGF1R) come target sinergici per DDL. Pertanto l'impiego di combinazioni di tecniche in vitro ed in silico appare come il modo più affidabile ed economico per scoprire sinergie nella modulazione multitarget. Le elevate prestazioni di tali approcci traslazionali potrebbero derivare dalla possibilità di ridurre al minimo le incertezze nei metodi di calcolo mediante dati di screening in vitro. Gli approcci computazionali si basano principalmente su dati molto eterogenei che possono essere migliorati con l'aiuto di esperimenti mirati in vitro. Inoltre la deconvoluzione in silico dei percorsi di targeting aiuta a ridurre l'influenza di potenziali attività fuori bersaglio delle sonde chimiche utilizzate. Pertanto gli approcci multidisciplinari possono fornire dati affidabili sulla sinergia di target come inevitabile punto di partenza per la scoperta di farmaci multitarget.
Al di là della previsione computazionale di combinazioni target sinergiche, si possono impiegare tecniche in silico di modellizzazione del flusso quantitativo per calcolare la misura in cui ciascun target deve essere modulato per produrre l'effetto terapeutico desiderato con effetti collaterali minimi. Il concetto di indirizzare più percorsi con basse dosi di farmaco postula che la massima efficacia terapeutica può essere raggiunta senza il pieno coinvolgimento del singolo target, ma piuttosto mediante una modulazione parziale dei vari target. In questo contesto, la cascata dell’acido arachidonico, che è stata al centro della scoperta di farmaci multitarget per diversi decenni, è stata ampiamente studiata. Ad esempio, Yang et al. hanno eseguito un'analisi del flusso risolto nel tempo dei singoli rami (cicloossigenasi e lipossigenasi) della rete metabolica dell'acido arachidonico nei leucociti polimorfi umani ed hanno quindi previsto le combinazioni di target più promettenti in termini di sinergia di effetti [15]. Successivamente, queste previsioni computazionali sono state confermate dall’analisi LC-MS/MS risolta nel tempo del profilo pro ed antinfiammatorio dei metaboliti dell'acido arachidonico. Gli sviluppi progressivi nel campo della modellazione quantitativa in silico delle vie metaboliche possono fornire ulteriori intuizioni per promuovere la scoperta di nuovi farmaci multitarget.
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Tabella 1. Tecniche in Silico disponibili per Identificare Combinazioni Sinergiche di Target [16] [17]
Approccio Applicazione
Approcci statistici
Analisi delle interazioni Bliss e Loewe analisi statistica di additività ed indipendenza combinate con analisi statistiche non parametriche su misura
Analisi di significatività delle
combinazioni mutante/farmaco analisi di set di dati chimico-genetici di batteri resistenti
Analisi dei profili di sottostruttura previsione dell'efficacia della combinazione di antibiotici Indice di concordanza probabilistica e
correlazione di Spearman ricampionata estrazione del set di dati NCI-DREAM Drug Synergy Prediction Challenge Approcci di apprendimento automatico
Apprendimento profondo analisi dello screening della combinazione farmacologica su diverse linee cellulari
Foresta casuale apprendimento delle caratteristiche fisico-chimiche e delle funzionalità di rete per prevedere combinazioni sinergiche di farmaci
Foresta casuale apprendimento della sinergia di farmaci antitumorali nel melanoma BRAF mutante Apprendimento semi supervisionato previsione della combinazione regolarizzata di farmaci sinergici minimi quadrati basata sulla rete di Laplacian
delle combinazioni di farmaci antifungini Analisi percorso/rete
Analisi statistica delle coppie estrazione di interazioni di mortalità sintetica clinicamente rilevanti
Convalida incrociata Monte Carlo analisi dell'inibizione dei percorsi incrociati
Mappa quantitativa di interazione chimico-genetica
impatto del knockdown dei geni correlati al cancro sulla risposta alle classi di chemioterapia
Modello di equazione differenziale ordinaria
previsione dell'efficacia delle combinazioni di farmaci all'interno della via di segnalazione EGFR-ERK
Simulazione di rete combinazioni di farmaci sinergici per il cancro al seno
Combinazione di diverse tecniche Analisi del percorso, apprendimento
automatico, analisi statistica identificazione farmacologica dei sistemi quantitativi delle vie protettive cellulari e combinazioni di farmaci Approcci combinati in silico/in vitro
Screen RNAi, analisi statistica combinazioni sinergiche di agenti terapeutici mirati con geni target essenziali nelle linee cellulari del cancro del colon-retto
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3. Identificazione ed ottimizzazione dei ligandi a targeting
multiplo
I composti multitarget possono essere classificati in tre tipologie generali sulla base della loro struttura molecolare e farmacoforica (Schema 1). La strategia più semplice per combinare più attività è la coniugazione di due o più gruppi farmacoforici mediante un opportuno linker. Si ottengono così molecole che (cfr. Sezione 3.2) tendono a possedere peso molecolare elevato e quindi numerosi svantaggi; tuttavia composti di questo tipo stanno acquisendo sempre più rilevanza nei processi di delivery mirato. Anche la coniugazione di due (o più) singoli farmacofori senza un gruppo di collegamento produce ligandi multipli fusi che tendono ad avere caratteristiche indesiderate come l'alto peso molecolare e l'estesa lipofilia. La strategia più ambiziosa e difficoltosa, ma anche più fruttuosa, nella ricerca di piccole molecole quali agenti multitarget, è quella di sviluppare ligandi multipli nella cui struttura (cfr. Sezione 3.3) i farmacofori sono sovrapposti nella misura in cui i loro rispettivi target biologici lo consentono. Sono possibili, ovviamente, varie forme intermedie tra le due ultime tipologie appena descritte (ligandi “fusi” e ligandi “sovrapposti”). I ligandi multipli “sovrapposti” possono essere progettati per possedere un basso peso molecolare e per soddisfare la Regola del Cinque di Lipinski [18], così da essere considerati drug-like. Tuttavia la progettazione di un composto nel quale si ritrovano sovrapposti i requisiti farmacoforici per i target biologici di interesse, e la sua successiva ottimizzazione ad un potente composto multitarget rappresentano sfide molto impegnative per i ricercatori.
3.1. Serendipity
In generale, è difficile definire con esattezza la percentuale di farmaci a targeting multiplo sviluppati da un design razionale o identificati per serendipity. Per quanto riguarda i primi antagonisti del recettore dell'istamina H1, erano state osservate
proprietà anestetiche ed antipsicotiche che poi sono state ulteriormente ottimizzate sulla base di modelli tissutali ed animali, e quindi il processo, iniziato per serendipity,
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ha poi coinvolto anche uno sforzo di ottimizzazione razionale. In uno scenario ottimale, la ricerca effettuata per serendipity è sempre coniugata con un'eccellente conoscenza, idee geniali e duro lavoro. In molti casi, la complessità del profilo di un composto viene rilevata nelle fasi successive dagli screening biologici. La selezione dei composti meritevoli di un ulteriore sviluppo viene quindi effettuata non solo sulla base della capacità di legame con il target originale, ma anche considerando l'efficacia biologica. Il profilo di efficacia viene quindi studiato in modo più approfondito per identificare i molteplici target coinvolti. Un profilo target così definito successivamente fornisce criteri di selezione più specifici e processi di ottimizzazione definiti in modo più chiaro da applicare sulle nuove strutture lead. Nel campo dei composti naturali, che rappresentano una sorgente ricca ed eterogenea di nuove strutture lead, le attività biologiche (multitarget) sono spesso rilevate da approcci di tipo “trial and error”. Importanti agenti oncologici ed antibiotici, tra cui gli alcaloidi della vinca ed i taxoli, le penicilline, i macrolidi e gli antibiotici peptidici, inizialmente definiti come monotarget, si sono in seguito rivelati capaci di indirizzarsi verso più target o sono stati ottimizzati per il targeting multiplo. La necessità di agenti multitarget è in costante aumento a causa dello sviluppo delle resistenze. Le strutture lead derivate da composti naturali sono diventate importanti punti di partenza per la sintesi parziale o completa, così come per i processi di ottimizzare volti allo sviluppo di composti multitarget sempre più potenti.
Anche nel campo degli inibitori multichinasici, molte scoperte iniziali relative all’attività multitarget sono state fortuite. Gli studi di relazione struttura-attività (SAR) e la disponibilità di dati strutturali, hanno poi consentito la progettazione razionale di nuovi inibitori multichinasici. Il composto CBS-3595 (1, Schema 2), inibitore duale della proteina p38 attivata da mitogeno (p38α/MAPK) e della fosfodiesterasi 4 (PDE-4) rappresenta un esempio di composto multitarget sviluppato da un’iniziale scoperta fortuita seguita da ottimizzazione razionale [19]. Durante lo studio del profilo di una serie di inibitori della p38α/MAPK in un modello sperimentale di endotossiemia, un composto ha mostrato un'efficacia in
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vivo significativamente più pronunciata di quanto ci si potesse aspettare dalla sua potenza in vitro. PDE-4 è stato quindi identificato come target secondario e lo studio delle SAR ha portato all'identificazione di 1, un inibitore duale p38α/MAPK/PDE-4, quasi equipotente per i due target. L’inibizione contemporanea di p38α/MAPK e PDE-4 attenua sinergicamente il rilascio di TNFα in vitro ed in vivo, rendendo 1 un candidato promettente per il trattamento delle malattie infiammatorie croniche.
Schema 1. Gli agenti multitarget possono derivare dal collegamento di farmacofori mediante appropriati linker stabili o biodegradabili, fusione di farmacofori o sovrapposizione di farmacofori per i target biologici di interesse [1]
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3.2. Farmacofori collegati mediante linker
Il modo più semplice di combinare razionalmente i farmacofori di due (o più) target distinti è la loro connessione mediante un linker stabile o biodegradabile. Il composto multitarget risultante sfrutta ancora i vantaggi di modulare più target con una singola molecola. Inoltre questa strategia offre un modo per combinare due potenti agenti che modulano target distinti senza la necessità di un'eccessiva ottimizzazione strutturale. Tuttavia il collegamento di due farmacofori di solito porta a molecole piuttosto grandi, che potrebbero non possedere biodisponibilità favorevole o non riuscire a raggiungere compartimenti intracellulari; inoltre la presenza del linker potrebbe ostacolare in modo significativo l'interazione con le proteine target, cosicché il tipo ed il punto di attacco dei linker diventa motivo per un cruciale processo di ottimizzazione.
La strategia di collegamento di farmacofori è attualmente di grande interesse nel campo dei coniugati di farmaci anticorpali, nei quali si sfrutta un farmacoforo (ad esempio l'anticorpo) come agente target che trasporta il secondo farmacoforo (una piccola molecola) nel sito desiderato di azione. Questo tipo di approccio consente per esempio, nel trattamento del cancro, l’applicazione di agenti altamente potenti, che però presentano una citotossicità troppo forte per poter essere usati in monoterapia. Il concetto di coniugati di anticorpi viene sempre più spesso trasferito nel processo di sviluppo di coniugati di piccole molecole [1].
3.2.1. Esempi di farmacofori collegati
La strategia di delivery mirato che è stata studiata mediante il collegamento di anticorpi con molecole citotossiche è stata investigata con successo anche legando due piccole molecole. Uno dei primi esempi di rilascio mirato alle cellule tumorali è stato riportato già nel 1992, quando farmaci citotossici sono stati legati ai derivati dell'acido colico, come farmacoforo target-specifico, capaci di favorire l’assorbimento dei composti specificamente nelle cellule target attraverso i trasportatori degli acidi biliari. Da allora, vari sistemi di trasporto e recettori della superficie cellulare sono stati utilizzati per trasportare composti multitarget a
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popolazioni cellulari specifiche, come, ad esempio, i recettori degli estrogeni, i recettori dei folati, i recettori sigma-2, l’antigene di membrana specifico della prostata, il sistema di trasporto delle poliammine e persino i trasportatori di glucosio. Inoltre l'affinità di un ligando per uno specifico sistema di trasporto o recettore della superficie cellulare può essere sfruttata anche a scopi di imaging, per modulare le proprietà farmacocinetiche o per consentire l’attraversamento di barriere fisiologiche come la barriera emato-encefalica.
Attualmente, sta attirando una notevole attenzione il trasporto mirato di antibiotici nei batteri, sfruttando i meccanismi di captazione batterica. A causa della loro necessità di acquisire ferro dall'ambiente circostante, i batteri producono ed espellono composti chelanti del ferro, i cosiddetti siderofori. Meccanismi specifici di assorbimento attivo quindi interiorizzano i complessi chelante-ferro per soddisfare il bisogno batterico di ferro. Questo sistema di trasporto attivo è stato sfruttato con successo per consentire l’assorbimento attivo di antibatterici, congiungendo un agente antibiotico ed un sideroforo mediante un linker (biodegradabile). Esistono anche sideromicine naturali come l'albomicina e la salmicina prodotte da streptomiceti; inoltre sono stati recentemente riportati in letteratura molti promettenti esempi sintetici di tali coniugati farmacologici (2a-c), che hanno mostrato una notevole potenza anche contro i ceppi multiresistenti. Alcune sideromicine vengono scisse dopo l'assorbimento dagli enzimi batterici per rilasciare il farmacoforo antibiotico. Uno degli esempi più promettenti della serie delle sideromicine è il cefiderocol (2c), attualmente in fase di studio clinico, efficace nei confronti dei patogeni Gram-negativi resistenti (Schema 3).
La strategia di collegamento di farmacofori, non con lo scopo di facilitare l'assorbimento, ma di determinare effetti farmacodinamici su entrambi i target tali da produrre una potenziale attività sinergica, ha attirato l'attenzione anche nel campo degli agenti antimicrobici. Sebbene questo campo sia piuttosto nuovo, antibiotici multitarget sviluppati secondo questo concetto potrebbero acquisire sempre più importanza in tempi di limitata disponibilità di agenti antimicrobici.
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Schema 3. Sideromicine (2a-c, ad esempio), composte da un sideroforo ed un potente antibiotico, sfruttano meccanismi batterici di assorbimento del ferro per il trasporto attivo dei coniugati nei batteri, dove poi il coniugato è scisso per liberare l'antibiotico; il cefiderocol (2c) è già entrato nello sviluppo clinico [1]
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3.2.2. Chimica dei linker
Nel processo di sviluppo di composti multitarget caratterizzati da due o più strutture farmacoforiche collegate, la chimica dei linker gioca un ruolo cruciale per ottenere le caratteristiche e gli effetti desiderati, in quanto il comportamento del ligando finale dipende fortemente proprio dal gruppo utilizzato come collegamento. La natura del linker può non solo influenzare in modo significativo l'attività sui target, ma anche modulare la farmacocinetica e determinare se e dove le molecole collegate possono essere rilasciate mediante scissione. La regiochimica è di particolare importanza per mantenere l'affinità dei farmacofori nei confronti dei loro target specifici e le informazioni sulle SAR dei singoli farmacofori devono essere disponibili per poter identificare le posizioni adatte per l'aggancio del linker. Linker appropriati possono migliorare la polarità e la solubilità, ridurre l'assorbimento non specifico del coniugato nelle cellule attraverso la diffusione passiva, e definire il sito e la cinetica della scissione del linker, ad esempio tramite dipendenza dal pH o sensibilità verso un certo enzima. Per i linker non scindibili, i punti di aggancio ai farmacofori, nonché la lunghezza e la geometria del linker, richiedono un'attenzione particolare.
Per gli agenti coniugati con un linker scindibile, il sito in cui si vuole che avvenga la scissione ed il rilascio dei singoli farmacofori rappresenta l’aspetto determinante da considerare nella selezione del linker più adatto. I linker che possono subire scissione (Schema 4) includono gruppi che sono labili alle condizioni acide (idrazoni, ossidi, tiomaleimmidi) o agli agenti riducenti (disolfuri), nonché linker che possono essere degradati dagli enzimi (linker di natura peptidica: la valina-citrullina viene scissa dalla catepsina B, i gruppi immidici sono idrolizzati dalle endopeptidasi; l'acido β-glucuronico viene scisso dalla β-glucuronidasi). Dopo la scissione del gruppo labile nel linker, i linker moderni possono subire reazioni intramolecolari che alla fine portano al rilascio totale del gruppo linker e dei suoi distanziatori dai farmacofori (distanziatori autoimmolativi, Schema 5).
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Schema 4. Tipici linker scindibili (alcuni esempi) labili alle condizioni acide o agli agenti riducenti, o progettati per essere scissi in modo specifico da alcuni enzimi [1]
Schema 5. Distanziatori auto-immolativi (alcuni esempi), subiscono reazioni intramolecolari per rilasciare completamente i singoli farmaci dal coniugato [1]
3.2.3. Ligandi fusi a targeting multiplo
Due piccole molecole bioattive indirizzate a due target possono anche essere fuse direttamente senza un linker che li collega. A seconda della natura del legame che collega i due composti, tali ligandi multipli fusi possono possedere un profilo di ligandi scindibili o non-scindibili, analogamente a quanto visto per i ligandi derivanti dalla coniugazione di due farmacofori mediante un linker. Ad esempio,
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più ligandi fusi nei quali la connessione è realizzata mediante porzione di natura esterea, imminica o idrazonica possono in vivo subire scissione. Così come la natura del linker rappresentava un punto cruciale di ottimizzazione per i coniugati linkati, il sito e le modalità di fusione dei farmacofori devono essere attentamente valutati ed ottimizzati. I ligandi multipli fusi, in particolare non scindibili, potrebbero non riuscire a mostrare le attività desiderate quando la fusione dei farmacofori ostacola il loro legame con i singoli target. In alcuni casi, questo può essere un ostacolo insuperabile, ad esempio, quando il sito di legame del ligando in un bersaglio è localizzato all'interno della proteina come nei recettori nucleari.
La semplice fusione di due farmacofori produrrà molecole abbastanza grandi e questo aspetto potrebbe sembrare a prima vista poco invitante. Tuttavia per alcune combinazioni di target che differiscono troppo per i chemiotipi dei ligandi che possono ospitare, la fusione dei farmacofori può rappresentare l’ultima ratio per generare un ligando multiplo con il profilo farmacologico desiderato [1].
3.3. Ligandi unificati a targeting multiplo
L’approccio più elegante per progettare piccole molecole che modulino più di un target è quello di fondere i loro farmacofori. Chiaramente, in questi ligandi multipli, le caratteristiche chiave del farmacoforo richieste per interagire con i target di interesse sono combinate in un farmacoforo unificato. Per poter realizzare questa strategia, è necessario che i farmacofori dei singoli target mostrino una certa sovrapposizione. Inoltre i siti di legame di entrambi i target di interesse devono essere in grado di legare gli stessi chemiotipi molecolari, in termini di geometria e distribuzione della carica. Gli elementi farmacofori chiave, come le funzioni acide, che sono presenti ad esempio nei mimetici degli acidi grassi o in gruppi capaci di legare i metalli, devono essere compatibili con il secondo target biologico. D'altro canto, deve essere tenuto in considerazione ed escluso il pericolo della promiscuità generale dei ligandi/modulatori multipli identificati [1].
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3.3.1. Strategie di identificazione dei composti lead per lo sviluppo di
ligandi multipli unificati
3.3.1.1. Approcci razionali
Lo step chiave nel processo di sviluppo di ligandi multipli unificati è l'identificazione del composto lead. Sono state utilizzate e validate diverse strategie per identificare le strutture di partenza adatte per lo sviluppo e la successiva ottimizzazione di composti multitarget. Quando sono disponibili composti attivi sui singoli target di interesse, le caratteristiche strutturali e farmacoforiche comuni di ligandi simili possono essere unite in modo sistematico a costituire i minimi farmacofori lead comuni. Le informazioni strutturali ottenute mediante studi a raggi X possono essere molto utili in questo passaggio per identificare le caratteristiche chiave del farmacoforo che sono cruciali per l'attività. Diversi progetti hanno portato con successo all’identificazione di ligandi multipli unificati mediante la combinazione razionale e sistematica di scaffold e sottostrutture comuni, contenute in ligandi selettivi per i target di interesse (Schema 6). Woo et al. [20] [21] [22] [23] (Schema 6A) hanno combinato i farmacofori per l'inibizione dell'aromatasi (3a) e l'inibizione della solfatasi steroidea (3b), ottenendo diversi inibitori duali di entrambi gli enzimi. L’unificazione iniziale dei farmacofori è stata ottenuta incorporando una porzione di fenolo solfammato, cruciale per l'inibizione irreversibile della solfatasi steroidea, in uno scaffold noto come inibitore dell’aromatasi. La strategia di unificazione del farmacoforo si basava su informazioni strutturali provenienti da co-cristalli e studi di docking molecolare ed ha consentito lo sviluppo di inibitori duali come 3c, con potenza nanomolare intermedia bilanciata. Studi approfonditi di SAR e variazioni dello scaffold centrale hanno consentito l’identificazione di vari chemiotipi di inibitori duali aromatasi/solfatasi steroidea tra cui per esempio il composto 3d, con potenze che scendono a valori picomolari.
Schmidt et al. [24] (Schema 6B) hanno unito i farmacofori per l'attivazione del recettore farnesoide X (FXR) (4a) e l'inibizione dell'epossido idrolasi (sEH) in forma
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solubile (4b), per generare un farmacoforo lead unificato minimizzato. Gli elementi chiave del farmacoforo, una porzione ammidica per mimare lo stato di transizione dell'idrolisi del substrato sEH ed una porzione di acido carbossilico per neutralizzare le interazioni con il sito di legame del ligando FXR, erano compatibili con una sottostruttura comune in una coppia di composti attivi noti, selettivi per FXR e sEH. Uno dei tre farmacofori unificati lead candidati (4c) possedeva una potenza duale moderata ed è stato ampiamente ottimizzato fornendo una serie di modulatori duali FXR/sEH (4d) con bassa potenza nanomolare, che possono rappresentare potenziali farmaci per il trattamento della steatoepatite non alcolica e delle relative malattie metaboliche.
L'antipsicotico atipico ziprasidone (5a) è stato razionalmente progettato a partire da due farmacofori per andare ad interagire con i recettori della serotonina 5-HT2 ed i
recettori della dopamina (Schema 6C). Il farmacoforo 5-HT2 della naftilpiperazina
(5b) è stato unificato con una frazione di indolone come farmacoforo antagonista della dopamina (5c), ottenendo di conseguenza l’antagonista duale 5d. La successiva ottimizzazione sistematica strutturale ha consentito lo sviluppo di 5a.
Bautista-Aguilera et al. [25] (Schema 6D) hanno progettato con successo ligandi multipli di colina esterasi (ChE), monoammino-ossidasi (MAO) e recettore dell'istamina H3 per applicazione nelle malattie neurodegenerative, unificando
razionalmente i farmacofori per ciascun target in una singola molecola. L'incorporazione di un farmacoforo di antagonismo H3 generale derivato da 6a
nell’inibitore duale compatibile ChE/MAO 6b ha generato il composto lead 6c con tripla potenza intermedia. Piccoli cambiamenti strutturali (6d) sono stati quindi sufficienti per ottimizzare la tripla attività a valori nanomolari bilanciati.
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Schema 6. Esempi di progettazione razionale di farmacofori lead unificati nello sviluppo di ligandi multipli [1]
(A) L'introduzione del fenolsulfammato, farmacoforo per l'inibizione della solfatasi steroidea, di 3b nell'inibitore dell'aromatasi 3a è stata sufficiente per progettare l'inibitore duale aromatasi/solfatasi steroidea 3c. I successivi studi SAR e modifiche dello scaffold centrale hanno prodotto diverse classi di potenti inibitori duali come 3d.
(B) I requisiti farmacoforici minimi per l'attivazione del recettore farnesoide X (FXR) (4a) e l'inibizione dell'epossido idrolasi in forma solubile (sEH) (4b) erano compatibili per la fusione nel farmacoforo lead duale 4c, con moderata potenza duale. 4c è stato ottimizzato in modo sistematico verso entrambi i target; ne risulta il modulatore duale 4d con doppia attività nel basso nanomolare.
(C) L'antipsicotico atipico ziprasidone (5a) è stato scoperto fondendo i farmacofori per l'antagonismo del recettore della serotonina 5-HT2 (5b) e l'antagonismo del recettore della
dopamina (5c) producendo l’antagonista duale 5d, che è stato ottimizzato in modo sistematico a 5a.
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(D) La progettazione del triplo farmacoforo lead 6c che incorpora elementi farmacofori per l'inibizione della colinesterasi (ChE) (da 6b), l'inibizione delle monoammino ossidasi (MAO) (6b) e l'antagonismo del recettore H3 dell'istamina (6a) mostra che anche l'attività su tre
singoli target può essere razionalmente progettata in una singola piccola molecola. Piccoli cambiamenti strutturali sono stati quindi sufficienti per ottimizzare 6c, trasformandolo nel potente modulatore triplo 6d.
3.3.1.2. Approcci computazionali basati su descrittori
Diversi approcci computazionali sono disponibili quali efficaci alternative all’approccio razionale per sviluppare strutture contenenti elementi farmacoforici per più target. Sono infatti disponibili banche dati sulle relazioni struttura-attività come ChEMBL o PubChem che possono essere utilizzate per costruire reti di interazione farmaco-target e per identificare scaffold adatti allo sviluppo di ligandi multipli unificati. Nell’applicazione di tale approccio, devono essere noti i descrittori molecolari caratteristici dei composti bioattivi, e le sequenze alfa-numeriche che codificano per specifiche strutture molecolari, “fingerprints”. Alcuni esempi di fingerprints includono semplici fingerprints relative a sottostrutture e fingerprints circolari, ma anche fingerprints relative all’interazione del ligando e descrittori di caratteristiche farmacoforiche. Con l’ausilio di tali descrittori molecolari, può essere computerizzata la somiglianza di composti attivi su due (o più) target di interesse per identificare ligandi simili. Pertanto i candidati con attività duale identificati possono quindi essere caratterizzati in vitro sugli altri target di interesse per i quali non siano disponibili dati di bioattività ed i composti risultati attivi possono servire da lead per lo sviluppo di ligandi multipli unificati.
In alternativa alle ricerche sistematiche sulla struttura dei composti lead basate sulla somiglianza dei composti, è possibile utilizzare anche banche dati di relazioni struttura-attività per generare modelli quantitativi di relazione struttura-attività (QSAR) che siano utili per prevedere la bioattività sui target di interesse. La costruzione dei modelli QSAR richiede un set di dati considerevolmente ampio relativo sia a composti attivi che a composti inattivi sui target di interesse, ma poi
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risultano molto utili per valutare la probabilità di nuovi composti di essere attivi su un determinato target. Molti studi hanno utilizzato con successo modelli QSAR per identificare modulatori duali per coppie di target specifici con basse percentuali di falsi positivi.
Inoltre l'intelligenza artificiale generativa sta guadagnando continuamente rilevanza nelle prime fasi del processo di scoperta di nuovi farmaci e potrebbe avere un enorme potenziale anche nella progettazione di composti multitarget. Recentemente, un modello di intelligenza artificiale generativa creato per analizzare i composti contenuti in ChEMBL rappresentati come stringhe SMILES, e messo a punto su un insieme di ligandi per due famiglie specifiche di target è stato impiegato con successo per identificare nuovi ligandi duali. Il vantaggio di questo metodo è che richiede molti meno dati relativi ai target di interesse rispetto alla maggior parte degli altri approcci e consente di ideare nuove entità chimiche che non si trovano nel data set di partenza [1].
3.3.1.3. Modelli di farmacoforo
L’elaborazione dei modelli farmacoforici fornisce la possibilità di un approccio computazionale complementare agli approcci basati sui descrittori sopra citati, per l'identificazione di ligandi multipli. I modelli di farmacoforo che descrivono “l'insieme di caratteristiche steriche ed elettroniche di un composto che è necessario per l'interazione con un bersaglio biologico” possono essere dedotti computazionalmente da un insieme di ligandi noti per quel determinato target (basati sul ligando, ligand-based) o da strutture co-cristalline (basate sulla struttura, structure-based). Rappresentano una disposizione tridimensionale di caratteristiche come gruppi donatori/accettori di legami idrogeno, residui carichi, interazioni aromatiche o contatti lipofili. Inoltre in questi modelli tridimensionali si possono definire volumi di esclusione per evitare collisioni con il target biologico, che porterebbero a composti inattivi anche se questi possiedono tutte le caratteristiche farmacoforiche positive.
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I modelli farmacoforici ligand-based sono generati sulla base di un set di composti noti attivi per un target di interesse. I composti attivi noti sono allineati al fine di identificare le caratteristiche farmacoforiche comuni da includere nel modello di farmacoforo. Poiché le conformazioni bioattive di questi ligandi non possono essere note senza informazioni strutturali, è necessario includere un numero di conformazioni preferenziali ad energia minimizzata per ogni ligando; ciò può richiedere notevoli tempi di calcolo. Tuttavia i moderni algoritmi dei software di modellazione del farmacoforo sono adatti per coprire lo spazio conformazionale tridimensionale di piccole molecole. Oltre al campionamento delle conformazioni preferibili dei ligandi, il loro allineamento è un elaborato compito computazionale. Ad esempio, le piccole molecole possono essere allineate sovrapponendo singoli atomi, gruppi di atomi (frammenti) o caratteristiche chimico/farmacoforiche secondo il concetto dei minimi quadrati; sono disponibili anche metodi basati su descrittori e le moderne tecniche di allineamento utilizzano, ad esempio, il riconoscimento della forma strutturale generale. Questo gran numero di fattori, che influenza la generazione del modello di farmacoforo oltre alla selezione del set di ligandi, può portare a notevoli variazioni nei modelli finali e, quindi, la modellazione del farmacoforo ligand-based è un compito impegnativo anche se si considera un singolo target.
La generazione di modelli farmacoforici structure-based offre il grande vantaggio che la conformazione tridimensionale ottimale del ligando può essere estratta dalla struttura co-cristallina. Inoltre le caratteristiche del farmacoforo possono essere definite dalle interazioni del ligando con il target biologico ed i volumi esclusi risultano dalla superficie del sito di legame. Tuttavia i modelli di farmacoforo structure-based derivati da una singola struttura co-cristallina non possono coprire l'intero spazio chimico di piccole molecole che potrebbero interagire con il target di interesse. Una struttura co-cristallina rappresenta solo una possibile conformazione "congelata" della proteina e, quindi, un modello farmacoforico structure-based non è capace di rappresentare l'adattamento conformazionale dovuto all’interazione con il ligando.
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Entrambi i modelli di farmacoforo, ligand-based e structure-based, hanno i loro limiti e spesso producono alti tassi di falsi positivi negli approcci di screening, portando all’identificazione di pochi composti attivi. Tra i fattori sfavorevoli ai processi di screening basati sui farmacofori vi sono una scarsa qualità dei dati, un numero limitato di composti inattivi noti, strutture cristalline errate ed un'implementazione computazionale limitata di alcuni tipi di interazione come il legame degli alogeni. Per ottimizzare l'output ad una percentuale massima di composti hit realmente attivi, i modelli di farmacoforo devono essere attentamente definiti e validati in modo incrociato se sono disponibili dati sufficienti. Sebbene i modelli farmacoforici siano spesso superati in termini di performance da approcci basati su descrittori quando si tratta di singoli target, essi rappresentano un valido approccio nel processo di identificazione di ligandi multipli.
Le strategie per ottenere ligandi multipli mediante l’ausilio dei modelli farmacoforici prevedono lo screening virtuale di librerie di composti per identificare potenziali ligandi o la progettazione de novo di piccole molecole che fittano con i modelli di farmacoforo. Per la scoperta di ligandi multipli mediante screening virtuale basato sul farmacoforo, sono necessari due screening individuali utilizzando i modelli farmacoforici di entrambi i target di interesse. In uno scenario ottimale, le librerie di composti analizzate contengono un set di conformazioni preferite ad energia minimizzata per ciascuna struttura in modo da identificare le conformazioni che fittano il modello farmacoforico, sebbene questo processo determini un aumento significativo del tempo di calcolo. È necessario definire un limite di tolleranza adeguato per tutti i singoli requisiti farmacoforici che devono essere fittati dai composti screenati, mentre alcuni requisiti potrebbero eventualmente essere definiti come opzionali. I composti che fittano i farmacofori di entrambi i target di interesse devono poi essere analizzati in modo più dettagliato, usando ad esempio il docking molecolare per validarli ulteriormente tramite simulazioni in silico, prima di essere testati sperimentalmente. In alcuni studi, seguendo questa strategia, si sono generati modelli di farmacoforo per i siti di legame dei ligandi di entrambi i target di interesse, e quindi si sono screenate librerie
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di composti per individuare strutture che fittano entrambi i modelli di farmacoforo. Queste molecole sono state poi dockate nei siti di legame di entrambi i target e quelle che sono risultate più promettenti sono state validate sperimentalmente con buoni tassi di successo.
In alternativa, possono anche essere sviluppati modelli farmacoforici che includono le caratteristiche farmacoforiche comuni di entrambi i target di interesse. Tali modelli, detti consensus model, possono derivare da informazioni strutturali di co-cristalli di ciascun target, da ligandi duali noti di entrambi i target o da una combinazione di entrambi. Un modello esemplare di doppio consensus model è stato costruito dockando ligandi duali noti nelle strutture di entrambi i target per identificare gli elementi farmacoforici comuni, che sono stati quindi utilizzati per definire i motivi comuni del modello.
Un approccio basato su farmacoforo duale ligand-based puro ha consentito di costruire modelli farmacoforici per gruppi di inibitori dell'epossido idrolasi in forma solubile (sEH) e della 5-lipossigenasi (5-LO). Successivamente, i modelli sono stati allineati a coppie per produrre modelli di farmacoforo duale. È importante sottolineare che l'allineamento ha permesso di variare le distanze tra le singole caratteristiche farmacoforiche in base al presupposto che i target possano condividere i ligandi a causa di elementi farmacoforici condivisi anche se questi elementi hanno distanze spaziali distinte. Lo screening virtuale pharmacophore-based, seguito da analisi degli scaffold ed una rifinitura delle caratteristiche dimensionali ed elettrostatiche, ha consentito l’identificazione di un nuovo inibitore duale (7) di sEH e 5-LO, con doppia potenza intermedia (Figura 1).
Il design de novo pharmacophore-based come strategia alternativa per ottenere piccole molecole attive dai modelli farmacoforici presenta il grande vantaggio che consente lo sviluppo di nuove entità chimiche piuttosto che l’identificazione di ligandi da librerie di composti noti. Sono state sviluppate numerose tecniche per "inventare" computazionalmente tali nuovi composti, inclusi approcci basati su reazioni che fondono unità strutturali semplici (building blocks), fusione di frammenti strutturali, ed applicazioni dell’intelligenza artificiale generativa. In tutti i casi, la progettazione
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de novo viene poi valutata usando modelli di farmacoforo per i target di interesse o un modello di consensus pharmacophore per selezionare i composti più promettenti da avviare a sintesi e successiva valutazione biologica. Lo svantaggio di questo approccio potrebbe essere la difficoltà sintetica dei composti progettati de novo.
Figura 1. Un approccio a farmacoforo duale ligand-based ha generato modelli di farmacoforo per inibitori dell'epossido idrolasi in forma solubile ed inibitori della 5-lipossigenasi.
Il successivo allineamento ha prodotto un farmacoforo duale (consensus pharmacophore) che, applicato in uno screening virtuale, ha consentito di identificare un nuovo inibitore duale (7) di entrambi gli enzimi [1]
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3.3.1.4. Identificazione di ligandi con targeting multiplo mediante
osservazioni cliniche
Oltre agli approcci ligand/drug-based e structure-based, anche gli approcci basati sulle osservazioni cliniche relative alla malattia (disease-based) risultano altrettanto promettenti per identificare ligandi multipli lead. L'analisi del network dei target biologici non solo può rivelare combinazioni sinergiche di target (cfr. Sezione 2.3), ma, insieme alle osservazioni degli effetti dei farmaci in via di sviluppo o già in uso clinico, può rivelare attività e target imprevisti per composti bioattivi noti che potenzialmente mostrano un'efficacia superiore. Tali attività collaterali di farmaci noti possono essere ottimizzate per identificare nuovi agenti selettivi in un classico processo di ottimizzazione selettiva delle attività collaterali (SOSA) o sviluppate per ottenere nuovi ligandi multipli. La ricerca traslazionale, che coinvolge le competenze di varie professioni, è fondamentale per identificare composti lead di ligandi multipli tra i farmaci derivanti da osservazioni cliniche, ma tali composti lead assumono un valore straordinario per la scoperta di ligandi multipli in quanto costituiscono già composti bioattivi ampiamente ottimizzati e sono drug-like per definizione.
La scoperta dell'attività modulante del PPARγ dell'antagonista AT1R telmisartan (8a) rappresenta un ottimo esempio di identificazione, tramite osservazioni cliniche, di un composto lead utile per il successivo sviluppo di farmaci multitarget. Inizialmente 8a aveva dimostrato la capacità di ridurre il glucosio plasmatico libero e l'insulina plasmatica libera, a differenza del losartan, antagonista competitivo dell'AT1R. Questa attività è stata ricondotta ad una parziale attivazione di PPARγ a concentrazioni farmacologicamente rilevanti. Una recente meta-analisi di 21 studi clinici randomizzati ha rivelato che il telmisartan migliora la resistenza all'insulina in termini di livelli di insulina e di glicemia a digiuno. Studi di relazione struttura-attività su una serie di derivati di 8a, agonisti parziali di PPARγ, hanno rivelato le caratteristiche strutturali cruciali richieste per il legame e l'attivazione di PPARγ. Sia AT1R che PPARγ presentano requisiti farmacoforici simili, e questo, mediante lievi modifiche strutturali del farmaco originale, ha consentito l’identificazione di potenti
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composti duali, antagonisti AT1R/agonisti parziali PPARγ, come 8b, dotato di efficacia in vivo (Schema 7).
Schema 7. Le osservazioni cliniche riguardanti la migliore sensibilità all'insulina nell'ambito del trattamento con Telmisartan (8a) hanno portato all’identificazione del suo potenziale di attivazione di PPARγ. L’ottimizzazione, mediante lievi cambiamenti strutturali, ha portato allo sviluppo di 8b preservando l'attività antagonistica originale AT1R [1]
