Approccio monolayer.

Sulla base della nostra personale esigenza di capire come funzionasse ciascuna parte del biosensore bioenzimatico (ruolo del mediatore, dell’ALDH e del cofattore) si è pensato inizialmente di adottare un approccio monolayer per studiare singolarmente o in maniera collettiva il comportamento dei vari costituenti del biosensore. L'approccio monolayer prevede che cofattore,

mediatore ed enzimi siano immobilizzati in un unico step nel film di polipirrolo durante la polimerizzazione del monomero.

ALDH.

In una prima fase è stato costruito un elettrodo che contenesse solo polipirrolo,

ALDH (direttamente responsabile della reazione redox a carico del substrato aldeidico) e cofattore -NAD+ _{(necessario per l'attività catalitica dell'ALDH,}

come descritto nella reazione 1). L'ALDH è stato sempre immobilizzato nel film polimerico durante la fase di elettrodeposizione. Il cofattore è stato invece a) aggiunto nella soluzione prima dell’analisi oppure b) immobilizzato direttamente nel film in crescita.

Cofattore in soluzione.

È stata effettuata una voltammetria ciclica della soluzione acquosa contenente pirrolo (0,05 M) e LiClO4 (0,1 M) (figura 2.22); essa mostra un processo anodico

a +0,90 V, dovuto all’ossidazione del monomero pirrolico. La caratterizzazione voltammetrica è stata condotta in assenza della componente enzimatica, per evitare di sottoporre quest’ultima a non necessari stress redox che ne avrebbero potuto danneggiare l’attività.

Figura 2.22. Voltammetria ciclica del sistema pirrolo 0,05 M e LiClO4 0,1 M in soluzione

acquosa, E=-0,50V ÷ +1,20 V, v=100 mV*s-1_.

Una volta valutato il potenziale di ossidazione del pirrolo, alla soluzione è stato aggiunto ALDH, in concentrazione pari a 1U*mL-1_.

La polimerizzazione è stata effettuata per via cronoamperometrica polarizzando l’elettrodo a +0,92 V per 300 s (figura 2.23) ed il film ottenuto è stato neutralizzato a E=+0,70 V per 300 s, e quindi caratterizzato in tampone fosfato pH 7,5.

Figura 2.23. Deposizione cronoamperometrica a +0.92 V del film di polipirrolo/ClO4-/ALDH in

tampone fosfato 0,1 M pH7,5.

La caratterizzazione (figura 2.24) del film in tampone fosfato 0,1 M pH 7,5 mostra un processo di doping a +0,80 V ed un largo processo di dedoping che va da -0,21 a -0,40 V.

Figura 2.24. Caratterizzazione del film di polipirrolo/ClO4-/ALDH 1 U*mL-1 in tampone fosfato

Alla soluzione di tampone fosfato pH 7,5 è stata quindi addizionata una quantità di cofattore -NAD+ _{tale da avere una concentrazione in cella pari a}

0,003 M. Utilizzando il biosensore Pt/PPy/ClO4-/ALDH è stata effettuata una

voltammetria ciclica su questo sistema che - com’è possibile osservare dalla figura 2.25 - lascia intravedere un nuovo processo anodico a +0,45 V, attribuibile alla riossidazione del -NAD+_{. Il picco, assente nella prima scansione, compare}

invece nei cicli successivi.

Figura 2.25. Caratterizzazione del film di Pt/PPy/ClO4-/ALDH in tampone fosfato pH 7,5 e β-

NAD+ _{0,003 M.}

A questo punto il biosensore Pt/PPy/ClO4-/ALDH è stato testato, in presenza in

soluzione del -NAD+_{, mediante voltammetria ciclica in un intervallo di}

potenziali tra -0,50 e +1,30 V in tampone fosfato pH 7,5 con aggiunte crescenti di HMF, rendendo la soluzione finale progressivamente 10-4_{, 10}-3_{, 5*10}-3 _{M in}

analita. La calibrazione è stata eseguita in condizioni potenziodinamiche in modo tale da valutare in tempo reale processi di ossidazione o riduzione a carico dell’aldeide. Confrontando i diversi voltammogrammi registrati per le varie concentrazioni di HMF (figura 2.26), e il voltammogramma riportato in figura 2.37, non si osservano nuovi processi anodici o catodici. Le apparenti

variazioni di corrente relative ai processi ossidativi a +0,50 V non sono correlabili con l’ossidazione del gruppo aldeidico.

Figura 2.26. Calibrazione del biosensore Pt/Ppy/ClO4-/ALDH in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,5 e

β-NAD+ _{0,003M; E = -0,50V ÷ +1,30 V, v= 100 mV*s}-1_{. [HMF] = 10}-4_{, 10}-3_{, 5*10}-3 _M.

La correlazione grafica delle intensità delle correnti in funzione delle concentrazioni del substrato aggiunto, riportata in figura 2.27, evidenzia una volta più in maniera inoppugnabile l’inadeguatezza del sensore ora messo a punto per la determinazione dell’HMF.

Figura 2.27. Dipendenza tra la risposta del biosensore e la concentrazione di HMF nel range

1x10-4 _{– 5x10}-3 _M.

Cofattore immobilizzato.

In una seconda prova l'elettrodo di Pt è stato modificato mediante deposizione di un unico film di polipirrolo/LiClO4/ALDH/ -NAD+. Dopo una preliminare

voltammetria ciclica esplorativa sul sistema pirrolo 0,05 M e LiClO4 0,1 M, di

aspetto del tutto analogo a quello osservato in prove precedenti (figura 2.22), è stato aggiunto l’enzima in concentrazione pari a 1 U mL-1 _{ed è stata effettuata}

direttamente la polimerizzazione a E= +1,0 V. Il polimero ottenuto è stato neutralizzato (come da esperimenti condotti in precedenza) a E= +0,60 V in tampone fosfato a pH 7,5 e quindi caratterizzato nella stessa soluzione. L’andamento del voltammogramma relativo alla caratterizzazione (figura 2.28) presenta un processo di doping a +0,80 V e uno di dedoping a –0,32 V. Per quanto riguarda il cofattore, l’assenza del picco relativo al processo di ossidazione è probabilmente attribuibile ad una sovrapposizione con il doping

polimerico, in quanto, generalmente, durante le voltammetrie cicliche è stato sempre osservato intorno a +0,60 V.

Figura 2.28. Caratterizzazione voltammetrica del biosensore Pt/Ppy/ClO4-/ALDH/β-

NAD+ _{in tampone fosfato pH 7,5; E= -0,50 V ÷ + 0,80 V v=100 mV*s}-1_.

Anche in questo caso la calibrazione del biosensore a +0,60 V non ha comunque portato ad apprezzabili variazioni di corrente per aggiunte crescenti di HMF (figura 2.29).

Figura 2.29. Calibrazione del biosensore Pt/Ppy/ClO4-/ALDH/β-NAD+ in tampone fosfato pH

7,5; [HMF] = 10-4 _{÷ 5*10}-3 _{M; E= +0,60 V.}

ALDH e Diaforasi.

Dopo aver verificato che l’immobilizzazione indipendente dell’ALDH, componente enzimatico funzionale all’ossidazione dell’HMF nei film di polipirrolo non permette di ottenere un biosensore in possesso di una risposta utile, si è ipotizzato in extrema ratio che ALDH e Diaforasi possano in qualche modo aver necessità d’operare in maniera sinergica, e si è pertanto deciso di bloccarli in un unico film polimerico in presenza sia del mediatore che del cofattore.

Questa volta il biosensore è stato preparato polimerizzando in cronoamperometria a E= +1,10 V una soluzione 0,05 M in pirrolo, 0,003 M in K4[Fe(CN)6], 0,003 M in β-NAD+, e contenenti ALDH e diaforasi, entrambi in

concentrazione pari a 1U*mL-1_{. Il polimero risultante è stato neutralizzato}

polarizzando l’elettrodo con esso modificato a E=+0,60 V per 300, indi è stato caratterizzato attraverso voltammetria ciclica in tampone fosfato pH 7,5, nell’intervallo di potenziali tra -0,40V e +1,0 V. Il film (figura 2.30) mostra un

processo anodico a +0,75 V associabile al doping del polimero, ed un picco a +0,05 V attribuibile a processi di de-doping, come rivelato da scansioni catoanodiche condotte tra -0,40 e +0,50 V, che evidenziano la graduale scomparsa del picco catodico. La calibrazione del biosensore monolayer è stata eseguita a -0,15 V in tampone fosfato 0,1 M pH 7,5 (figura 2.31).

Figura 2.30. Caratterizzazione del film di polipirrolo/K4[Fe(CN)6]/NAD+/ALDH/Diaph in

tampone fosfato a pH 7.5.

Figura 2.31. Calibrazione del biosensore monolayer Pt/PPy/K4Fe(CN)6/NAD+/ALDH/Diaph in

Come evidenziato dalla curva di calibrazione riportata in figura 2.31, le aggiunte di quantità crescenti di HMF non hanno portato ad alcuna variazione significativa della corrente monitorata dal biosensore. È stato per tale motivo deciso di adottare un approccio bilayer.