Immobilizzazione enzimatica con BSA e GA.

Ipotizzando che le tecniche d’immobilizzazione enzimatica per intrappolamento possano essere non ottimali per questo tipo di biosensori, ed anche sulla base dei risultati soddisfacenti ottenuti nella prima parte della tesi immobilizzando l'enzima GOx (vedi paragrafo 2.3.3 b – biosensore per il glucosio) attraverso la tecnica di cross-linking con BSA e GA, si è deciso di testare questa strategia dapprima per l’ALDH, e poi per la coppia ALDH/diaforasi.

ALDH.

L’elettrodo di Pt è stato modificato con un film di polipirrolo, usando LiClO4

come elettrolita di supporto. Il voltammogramma della soluzione di pirrolo (0,05 M) e di LiClO4 (0,1 M) è stato registrato tra -0,50 e +1,20 V. Come mostra la

figura 2.46 si nota un processo anodico tra +0,83 e +1,20 V, attribuibile all’ossidazione del frammento pirrolico. La polimerizzazione è stata quindi effettuata per cronoamperometria, imponendo un potenziale costante di +1,0 V all’elettrodo lavorante per 300 s, ed il polimero è stato quindi neutralizzato polarizzando il deposito a 0 V, sempre per 300 s, in tampone fosfato pH 7,5.

Figura 2.46. Voltammetria ciclica del sistema pirrolo 0,05 M, LiClO4 0,1 M in tampone fosfato

pH 7,5.

Il film polipirrolico è stato quindi modificato immergendolo dapprima per 10 volte in una soluzione di ALDH (4,5 U/500µL) in tampone fosfato 0,1 M pH 7,5, poi un'unica volta dapprima in una soluzione di BSA 2% e poi in GA 1%. Il biosensore è stato quindi caratterizzato mediante voltammetria ciclica in tampone fosfato 0,1 M a pH 7,5 ed in presenza di -NAD+ _{0,003 M (figura 2.47).}

Per questo step, facendo riferimento alla reazione 1 si è deciso di non coinvolgere il mediatore.

Figura 2.47. caratterizzazione del film Ppy/ClO4- in tampone fosfato 0,1 M pH 7,5; E= -0,50 V ÷

+1,10 V, v=100mV*s-1_.

Il dispositivo è stato calibrato, attraverso voltammetria ciclica scansionando il potenziale tra -0,50 V e +1,10 V, con aggiunte crescenti di HMF (soluzioni finali pari rispettivamente a 10-4_{, 10}-3_{, 5*10}-3 _{M in analita). Lo scopo dell’esperimento}

era quello di valutare l’insorgenza di eventuali variazioni morfologiche del voltammogramma, in seguito ad aggiunte progressive di analita. I voltammogrammi, singolarmente registrati per ciascuna concentrazione di HMF e quindi sovrapposti, sono riportati in figura 2.48. Com’è facilmente constatabile dall’osservazione della figura non vi è alcuna variazione della morfologia del responso voltammetrico che possa esser in qualche modo associato alle aggiunte di analita, come poi confermato da analogo esperimento effettuato in cronoamperometria anche su range di concentrazioni di analita inferiori di alcuni ordini di grandezza a quelle utilizzate in CV.

Figura 2.48. Calibrazione del biosensore in voltammetria ciclicanel range di potenziali compreso

tra -0,50 ÷ +1,10 V. v= 100mV*s-1_{, tampone fosfato a pH 7,5 e β-NAD}+ _{0,003 M, con [HMF] = 10}-4_,

10-3_{, 5*10}-3 _M.

Dal momento che l’immobilizzazione del solo enzima ALDH tramite cross- linking con BSA e GA non ha fornito evidenze di biosensori funzionanti, si è di nuovo ipotizzato – come già accaduto per i tentativi di immobilizzazione per polimerizzazione single layer - che il funzionamento del dispositivo potesse essere dovuto all’azione sinergica dei due enzimi. Pertanto anche in presenza di agenti cross-linkanti quali BSA e GA si è deciso di costruire un biosensore in cui sia ALDH che la diaforasi fossero contemporaneamente presenti.

È stato quindi depositato su un elettrodo di Pt un film di polipirrolo a partire da una soluzione acquosa di 0,05 M in monomero, 0,01 M in K4[Fe(CN)6] e 0,003 M

in -NAD+_{. La figura 2.49 riporta il voltammogramma relativo a questo sistema,}

in cui è possibile notare la formazione di un nuovo picco a circa +0,60 V dovuto all’ossidazione del NADH, mentre il picco a ca. +0,40 V ed il picco di ritorno associato a +0,1 V sono attribuibili rispettivamente all’ossidazione e alla riduzione del mediatore.

Figura 2.49. Voltammetria ciclica del sistema pirrolo 0,05 M, K4[Fe(CN)6], 0,01 M, NADH 0,003

In funzione di quanto emerso dalla voltammetria ciclica si effettua la polimerizzazione in cronoamperometria a +0,95 V per una durata di 300 secondi. Il film, neutralizzato come nelle prove precedenti e caratterizzato in tampone fosfato a pH 7,5, è stato quindi modificato con i biocatalizzatori.

La deposizione degli enzimi è stata eseguita attraverso immersioni rapide dell’elettrodo modificato in soluzioni contenenti gli enzimi, ALDH e diaforasi (entrambi in concentrazioni pari ad 1 U/mL in soluzioni tampone fosfato rispettivamente a pH = 7 e pH = 8).

I due enzimi sono stati bloccati sulla superficie del polimero tramite cross- linking con albumina di siero bovino (BSA) 2% e glutaraldeide (GA) 1% (preparata diluendo 80 μL di una soluzione di A al 25% in 1 mL di tampone fosfato pH 7,5).

Il biosensore è stato lasciato asciugare a temperatura ambiente per 30 minuti e quindi sottoposto a calibrazione ad un potenziale di -0,15 V utilizzando soluzioni di HMF a concentrazione nota e crescente compresa tra 1*10-8 _{M e 10}-4

M (figura 2.50).

Figura 2.50. Grafico corrente tempo per il biosensore Pt/PPy- [Fe(CN)6]3-/4-/

-NAD+_{/ALDH/Diaph/BSA/GA in tampone fosfato pH 7,5 con HMF = 1*10}-8 _{÷ 1*10}-4 _{M a E=-0,15}

Come si può notare dalle figure 2.51 e 2.52, la risposta del biosensore sembra limitata a valori di concentrazione bassi (da 2*10-8 _{a 2*10}-7 _{M), con un range di}

linearità di solo un ordine di grandezza. Nonostante in letteratura siano riportati diversi contributi relativi a biosensori che rispondono in maniera lineare anche per un solo a ordine di grandezza di concentrazione, si è cercato di estendere l’intervallo di applicabilità, ipotizzando che il numero di unità enzimatiche inglobate fosse insufficiente per l’impiego del dispositivo a concentrazioni d’analita superiori a 10-6 _{M. Si è inizialmente deciso di}

aumentare il numero di immersioni dell’elettrodo modificato con il film polimerico, passando da 10 fino a 20 dip. Questa prima variazione non ha portato a miglioramenti sensibili nell’intervallo di linearità del biosensore, pertanto si è pensato di aumentare direttamente la concentrazione delle soluzioni enzimatiche (da 1 U/mL fino a 15 U/mL), e quella del cofattore (3*10-3

÷ 3*10-2_{). Anche questa seconda variazione non ha purtroppo portato ad un}

incremento del range dinamico lineare del biosensore.

Figura 2.51. Calibrazione biosensore Pt/PPy-K4[Fe(CN)6]-β-NAD+/ALDH/Diaph/BSA/GA in

Figura 2.52. Linearità di risposta del biosensore Pt/PPy-K4[Fe(CN)6]-β-

NAD+_{/ALDH/Diaph/BSA/GA in tampone fosfato 0,1 M pH 7,5 con HMF a E = -0,15 V. [HMF] =}

1*10-8 _-2*10-7 _M.