Biosensori per la determinazione dei polifenoli.

Sulla base dei positivi risultati preliminari ottenuti nella messa a punto di un biosensore per il glucosio, in cui l’enzima glucosio ossidasi viene immobilizzato mediante la tecnica del cross-linking con glutaraldeide su film di politiofene (ottenuti a partire da un monomero commerciale ed uno di sintesi), si è pensato di costruire un biosensore per la determinazione dei polifenoli che utilizzasse analoghi polimeri conduttori, sui quali il gruppo di ricerca all’interno del quale questa tesi è stata sviluppata ha una più che decennale esperienza. Inizialmente si è cercato di sfruttare alcuni dei monomeri tiofenici sintetizzati in precedenza da questo gruppo di ricerca (Br-BT-TPA ed ET-BT-TPA), sui quali è stata immobilizzata la tirosinasi mediante cross-linking con glutaraldeide.

La scelta di questi specifici monomeri è stata dettata sia da fattori di specifica disponibilità dei monomeri (tutti di non facile e laboriosa sintesi), ma soprattutto dal fatto che la presenza di sostituenti stericamente ingombranti poteva più agevolmente creare – all’interno del network polimerico – “cavità” ove meglio poteva esser ospitato l’enzima. Infine, la riportata applicabilità di questi polimeri per gli scopi del lavoro anche in assenza di loro neutralizzazione poteva avere un ruolo nello stabilizzare – tramite opportune interazioni elettrostatiche – l’enzima immobilizzato all’interno della matrice polimerica.

Per ogni singolo monomero è stato valutato il comportamento elettrochimico attraverso prove di voltammetria ciclica. Sono stati valutati dunque i potenziali di ossidazione dei monomeri bitiofenici e la loro tendenza alla polimerizzazione in condizioni potenziodinamiche e potenziostatiche sia su elettrodi di Pt che su elettrodi di Au. I polimeri sono stati depositati in cronoamperometria in modo

tale da poter avere un miglior controllo della densità di carica e quindi dello spessore del film polimerico.

Come già prima accennato, non si è ritenuto opportuno neutralizzare i film polimerici così ottenuti, che quindi sono stati utilizzati tali e quali dopo la loro elettropolimerizzazione.

I film polimerici depositati su Pt e su Au sono stati successivamente caratterizzati con approcci a potenziale controllato per valutarne la loro conducibilità e la loro stabilità in un range significativo di potenziali elettrodici. Infine gli elettrodi risultanti sono stati modificati depositando sulla superficie dell’elettrodo modificato 15 μL di una soluzione di Tirosinasi, preparata solubilizzando 20 mg di enzima in 0,5 mL di tampone fosfato 0,1 M a pH=7. L’enzima è stato quindi immobilizzato depositando 2 aliquote da 5 μL ciascuna di una soluzione di glutaraldeide al 2,5% (v/v) in tampone fosfato 0,1 M a pH=7 sempre sulla superficie del trasduttore (3). I biosensori preparati sono stati infine conservati a 4°C.

La risposta del biosensore è stata tipicamente valutata sulla base dell’andamento delle correnti di stato stazionario misurate dopo aggiunte multiple di una soluzione standard di catecolo in una soluzione di tampone fosfato 0,1 M a pH 7 (5 mL). E’ in questa sede opportuno precisare che, diversamente da quanto descritto per la quasi totalità delle misure in voltammetria ciclica ed in cronoamperometria effettuate durante questo studio, nel caso delle misure analitiche basate sulla risposta della tirosinasi si deve lavorare in presenza di O2. L’ossigeno è infatti necessario affinché l’enzima sia

in grado di esplicare la propria attività nel processo di ossidazione del catecolo al corrispondente chinone, che viene successivamente ridotto sulla superficie dell’elettrodo (10).

Figura 2.55. Schema generale dell’azione di ossidazione del catecolo per effetto del biosensore a base di tirosinasi.

La risposta amperometrica del biosensore ad aggiunte crescenti di analita è stata valutata in cronoamperometria, polarizzando l’elettrodo a -0,20 V vs Ag/AgCl, ovvero al valore di potenziale al quale si osserva la riduzione del chinone prodotto per via enzimatica. Una volta stabilizzato il segnale della corrente per una soluzione di tampone fosfato a pH 7, si procede con l’aggiunta di quantità crescenti di analita, a partire da una soluzione a concentrazione nota. Prima di procedere con l’aggiunta successiva si attende che il segnale della corrente si stabilizzi.

2.6.1 Polimerizzazione elettrochimica di 4-(4’-bromo-2- ’-bitiofenil)-N,N’- difenilanilina (Br- BT-TPA) su disco di Au e su disco di Pt in CH2Cl2/TEAPF6 0,1 M.

La caratterizzazione voltammetrica del Br-BT-TPA su elettrodo lavorante di Au (figura 2.56) mostra la presenza di un picco anodico a +1,25 V, attribuibile all’ossidazione del frammento tiofenico, cui è associato un picco di ritorno a +0,70 V.

Figura 2.56. Caratterizzazione voltammetrica di una soluzione 5x10-3 _{M di Br-BT-TPA}

in CH2Cl2/TEAPF6 0.1 M. WE=Au, RE=Ag/AgCl, CE=grafite, v=100mV/s.

Scansioni ripetute del potenziale tra -0,2 V e +1,48 V (figura 2.57) hanno evidenziato un incremento della corrente con corrispondente formazione di un film sull’elettrodo. li elevati valori di potenziali di ossidazione usati sono dovuti alla difficoltà di polimerizzazione del ditiofene, attribuibile alla presenza del sostituente N,N-difenilanilinico che in qualche modo gioca un ruolo nella formazione di specie oligomeriche solubili nel sistema solvente utilizzato. Lavorando su intervalli di potenziale meno anodici non si osserva infatti la formazione del polimero.

Figura 2.57. Scansioni ripetute del potenziale tra -0.20 V e +1.60 V su elettrodo di Au di una soluzione 5x10-3 _{M di Br-BT-TPA in CH2Cl2/TEAPF6 0.1 M.}

La deposizione dei film polimerici su Au è stata effettuata in cronoamperometria, a valori di potenziale tali da garantire l’ossidazione del frammento tiofenico e compresi tra +1,0 V e +1,20 V, per tempi variabili ottenendo film di spessore compreso tra 751 nm e 3,2 µm. I depositi polimerici di poli(Br-BT-TPA) sono stati caratterizzati in una soluzione contenente il solo sistema solvente CH2Cl2/TEAPF6 0,1 M: si evidenzia un processo di doping che,

in funzione dello spessore, è compreso tra +1,10 e +1,30 V, con de-doping tra +0,76 e +0,62 V.

Questo comportamento è dovuto alla maggiore o minore facilità che incontra il controione dell’elettrolita di supporto a penetrare all’interno del bulk polimerico e controbilanciare la carica relativa allo stato dopato. Per questo motivo depositi polimerici più spessi, soprattutto con una morfologia molto densa e compatta, avranno più difficoltà ad andare incontro a fenomeni di ossidazione o di riduzione, e questo si riflette nello spostamento dei potenziali dei rispettivi processi verso valori, rispettivamente, più anodici o più catodici.