4. UTILIZZO CLINICO GENERALE DEGLI INIBITOR
4.5 Attivatori dell’Anidrasi Carbonica come potenziali farmaci nelle condizioni di deficit
Il meccanismo di attivazione delle CA è stato studiato mediante spettroscopia elettronica ed è risultato che una volta legati a vari isoenzimi come CA-I, -II, -IV, - VA, -VII, -XIII e -XIV, i CAA partecipano alla fase determinante della velocità del
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ciclo catalitico, ad opera di un residuo di istidina posto al centro della cavità del sito attivo, che funge da shuttle per il protone. Studi recenti come quelli condotti da Sun et al. (2002), indicano che l’attivazione di CA, fornisce un meccanismo rapido ed efficace per aumentare le concentrazioni di HCO3- in strutture neuronali legati alla
memoria. L’aumento di efflusso di HCO3- attraverso il canale dei recettori sinaptici
GABAA, altera le risposte neuronali postsinaptiche al GABA e quindi le risposte
neuronali a diversi input di segnale (figura 35). In questo modo, la CA funziona come un efficace check-point per il controllo della trasmissione del segnale attraverso la rete neurale [36].
Figura 35 Alterazione del segnale GABAergico ad opera dei CAA , all’interno dei
neuroni piramidali dell’ippocampo coinvolti nel consolidamento della memoria spaziale.
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Molte ammine e amminoacidi (ad esempio, adrenalina, noradrenalina, dopamina, istamina, istidina, imidazolo, fenilalanina e 5-HT) sono attivatori delle CA. Essi, facilitano il passaggio tra gli eccitatori e inibitori della stimolazione del recettore GABAA. Questo studio ha dimostrato che la somministrazione a livello centrale di
CAA (ad esempio imidazolo e fenilalanina) aumenta significativamente la capacità di apprendimento dei ratti nel memorizzare il percorso di un labirinto acquatico e di richiamarlo anche in seguito. Questi effetti di apprendimento sono sensibili all’Acetazolamide 1, quindi l’uso di CAA per aumentare l’efficacia della trasformazione sinaptica negli interneuroni che rilasciano GABA, può portare a un miglioramento della memoria e dell’apprendimento. L’attivazione delle CA rappresenta un approccio promettente e inesplorato per aumentare l’attività cerebrale, con potenziali benefici significativi in soggetti anziani o in pazienti affetti da morbo di Alzheimer e altre forme di demenza[36]. A tale scopo si è dimostrato di particolare interesse una molecola studiata dal gruppo di ricerca di Draghici nel 2014, si tratta di un derivato bis-imidazolico in cui due molecole di imidazolo sono legate attraverso i carboni in posizione 4 dell’anello tramite un ponte etilenico.
Figura 36 Struttura generale dei bis-imidazoli studiati come CAA[37].
Una volta testati in vitro su 8 isoforme di CA predominanti nell’omeostati cerebrale, è stata notata una particolare suscettibilità per le isoforme CA-VA e –VII, le quali
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rispondono all’attivazione da parte del CAA nell’ordine del nanomolare. La loro potenza e selettività nei confronti degli isoenzimi CA presenti a livello del cervello, insieme con la loro ottimale lipofilia, li raccomandano come nuove potenziali molecole per la delucidazione del ruolo di attivatori di CA-VA e CA-VII nella fisiologia cerebrale e come potenziali modulatori di apprendimento, memoria e funzioni cognitive [37].
5 Fisiopatologia delle Anidrasi Carboniche nelle cellule
tumorali
La neoplasia è una massa abnorme di tessuto, la cui crescita supera in modo scoordinato quella dei tessuti normali e progredisce nello stesso modo eccessivo anche dopo la cessazione degli stimoli che ne hanno causato l’insorgenza. Le cellule danneggiate, vengono eliminate attraverso un meccanismo di morte programmata, detto “apoptosi”; le cellule cancerogene, invece, evitano tale meccanismo e vanno incontro a proliferazione incontrollata.
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Figura 37 Differente comportamento tra le cellule sane e le cellule tumorali.
L’eziologia del cancro è ancora poco conosciuta, ma indicazioni sulla sua insorgenza, si possono ottenere attraverso studi epidemiologici, che mettono in relazione fenomeni ambientali, culturali ed ereditari. Il rischio di insorgenza dei tumori, aumenta con l’età a causa del fatto che con il passare degli anni si ha una maggiore esposizione ai fattori cancerogeni e contemporaneamente si ha una diminuzione delle difese da parte dell’organismo. Fondamentalmente, si tratta di una malattia dei geni delle cellule somatiche, in cui per motivi ereditari o per motivi di esposizione ad agenti fisici, come le radiazioni, o chimici o biologici si accumulano una quantità tale di mutazioni in specifici geni, in modo da determinare una modificazione della cellula sana a cellula tumorale. Le cellule tumorali presentano numerose differenze rispetto alle cellule sane:
• Si ha una perdita del controllo della proliferazione cellulare, ovvero, le cellule si replicano anche in assenza del segnale di crescita, questo avviene
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in quanto acquisiscono insensibilità ai fattori che bloccano la crescita cellulare, infatti, si ha perdita dell’inibizione da contatto con le cellule vicine, si replicano anche in assenza dei segnali di attivazione della mitosi, manca qualsiasi regolazione nella progressione del ciclo cellulare, in molti tumori si è visto mancare il check-point G1-S;
• Sono cellule resistenti al segnale apoptotico, la cellula tumorale diventa immortale con una capacità proliferativa illimitata, diversamente dalle cellule sane che si dividono per un certo numero di volte (60-70volte); • Le cellule cancerose hanno anche la capacità di promuovere l’angiogenesi,
la capacità di creare nuovi vasi sanguigni che si allacciano alla rete vascolare già esistente. I nuovi vasi portano ossigeno e nutrienti all’interno del tumore nascente, sostenendone la progressione e assecondandone la maggior richiesta nutritiva;
• Le cellule tumorali promuovono la migrazione e l’invasione dei tessuti formando le metastasi. Inizialmente si ha un’invasione locale e in seguito le cellule tumorali entrano nel torrente circolatorio. Escono dal flusso sanguigno attraverso la parete dei vasi e penetrano nei tessuti di organi anche molto distanti dal tumore primario, formano dei piccoli noduli dando luogo al processo noto come “microcolonizzazione”.
Altra caratteristica importante è l’ipossia, il tumore è caratterizzato da un inadeguato apporto di ossigeno.[38].L’ipossia è stata associata ad una condizione sfavorevole per il paziente in quanto esiste una correlazione tra la resistenza alla radioterapia e ai chemioterapici comuni. Il fatto che molti tumori sono ipossici e acidi allo stesso tempo, rispetto ai tessuti sani dello stesso tipo, è stato per molto
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tempo conosciuto come effetto Warburg, ma è stato spiegato a livello molecolare solo di recente, dopo la scoperta del fattore di trascrizione che regola questi fenomeni, il fattore inducibile dell’ipossia α, HIF-1α. Si tratta di un etero dimero costituito da una subunità α (100-120 KDa), la cui espressione e attività sono regolate dalla concentrazione di O2 e da una subunità β (91-92 KDa) che è
costitutivamente espressa nell’organismo. Esistono, inoltre, tre differenti subunità α, ma le più importanti e studiate sono le prime due che sono strettamente correlate tra loro ed hanno un 48% di omologia, mentre la HIF-3α è espressa in diverse varianti splicing e il suo ruolo non è ancora ben compreso.
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Come si può vedere dalla figura sopra riportata l’HIF-1α, in condizioni di normossia è instabile, essendo degradato rapidamente da un processo biochimico. In presenza di ossigeno, una prolil-idrossilasi va ad idrossilare la sub unità HIF-α su due residui di prolina, questa modifica permette il legame con la proteina oncosoppressore pVHL (Von Hippel Lindau) tramite interazioni a idrogeno, a sua volta provoca ubiquitinilazione e degradazione all’interno dei proteosomi. In condizione di ipossia, il gene che codifica per la proteina di Von Hippel Lindau risulta essere mutato. Il legame di pVHL con HIF-α viene quindi inibito, con conseguente accumulo di HIF-α e sua dimerizzazione con la subunità costitutiva HIF-β. L’elevato livello di HIF-α porta ad una sovraespressione di numerosi geni, tra cui quello che codifica per CA IX. Essa è di estrema importanza, in quanto stabilizza il pH dell’ambiente intracellulare a condizioni favorevoli per la crescita e l’invasione del tumore stesso.
Figura 39 Meccanismi attraverso i quali HIF interviene nell’omeostasi del pH nelle
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La CA-IX nell’ambiente tumorale acidifica il pH extracellulare,nelle normali cellule adulte differenziate,il pHi è ~7,2 ed è generalmente minore del pHe che è
~7.4. Tuttavia, le cellule tumorali hanno un pHi >7.4, ovvero maggiore del pHe che
è ~6.2–7.1. Questo gradiente invertito rispetto alle cellule sane, crea una condizione favorevole per la proliferazione cellulare, facilita l’adattamento metabolico ed è necessario per un’efficiente migrazione metastatica. La diminuzione del pHe delle
cellule tumorali è causato da una combinazione di carenza di ossigeno per la limitata perfusione, di aumento dell'efflusso intracellulare di H+ e di elevata attività
delle CA-IX e CA-XII (Figura 40b), le quali hanno domini catalitici extracellulari che accelerano l'idratazione di CO2 extracellulare a HCO3- e H+. L’aumentato
efflusso di H+ è determinato principalmente dall’azione di due trasportatori: MCT- 4 e NHE-1. Il primo agisce facendo entrare uno ione Na+ e facendo fuoriuscire un protone H+, il secondo invece agisce da co-trasportatore espellendo una molecola di acido lattico e un protone H+. L'espressione delle isoforme MCT-4 , NHE-1 e NHE-6 subisce una up-regulation in condizioni di ipossia attraverso l'attivazione trascrizionale di HIF-1, il quale, inoltre, influenza anche l'attività di scambio di NHE-1, aumentandola. Questa alterazione del pHe promuove il rimodellamento
della matrice extracellulare (ECM) e stimola le proteasi attivate dall'acido per facilitare l'invasione e la disseminazione delle cellule tumorali[41]
Le metalloproteinasi attivate dal pH acido oltre a contribuire alla crescita e alla metastasi del tumore, degradano la matrice extracellulare e di conseguenza promuovono la formazione di nuovi vasi sanguigni. È evidente quindi che l’acidità gioca un ruolo fondamentale nella proliferazione delle cellule tumorali.[42]
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Figura 40 Effetti provocati dal pH alterato all’interno delle cellule tumorali e nei
loro dintorni extracellulari (a). Meccanismi patologici di regolazione del pH nella cellula tumorale (b)[41].
In conclusione, vista la centralità del ruolo degli isoenzimi CA-IX e CA-XII nello sviluppo del tumore e la loro espressione prevalente sulla superficie delle cellule cancerose, essi forniscono un eccellente bersaglio per il trattamento di alcuni tumori solidi.