4. UTILIZZO CLINICO GENERALE DEGLI INIBITOR
5.1 Inibitori dell’Anidrasi Carbonica usati come potenziali farmaci antitumorali
Le CA-IX appartiene alla famiglia delle α-CAs umane molto attive e le sue proprietà catalitiche della reazione di idratazione della CO2 sono paragonabili a
quelle del catalizzatore CA-II. Come per tutte le α-CAs,la CA-IX è sensibile all’inibizione da parte di anioni, solfonammidi e sulfamati. Gli inbitori si coordinano con lo ione zinco direttamente dentro la cavità del sito attivo e
63
partecipano a varie interazioni favorevoli con residui amminoacidici, situati nel mezzo idrofobico e idrofilico del sito attivo. I composti solfonammidici aromatici hanno mostrato di:
-invertire l’effetto dell’acidificazione tumorale;
-inibire la crescita delle cellule cancerose con valori di IC50(corrispondenti alla
molarità degli inibitori che producono il 50%di inibizione delle cellule tumorali dopo 48 ore di esposizione al farmaco) nel range del micromalare (metazolamide, etossizolamide, indisulam);
-sopprimere l’invasione del tumore mediate dalle CAs associate al cancro(acetazolamide).
Teicher e colleghi hanno dimostrato che l’acetazolamide somministrata da sola ha un’azione antitumorale maggiore, mentre se è somministrata in combinazione con altri agenti chemioterapici, la sua azione si riduce notevolmente. Recentemente, è stato dimostrato che l’Indisulam, un derivato solfonammidico, originariamente chiamato E7070 agisce come inibitore di CA-IX e CA-XII. Oltre a legare la CA mediante lo zing-binding group inibisce anche le chinasi ciclino-dipendenti (CDK), è coinvolto nell'inibizione della fosforilazione della proteina del retinoblastoma (pRb) e nell'espressione differenziata di molecole che partecipano all'adesione cellulare, ai segnali e alla risposta immunitaria, oltre alle sue proprietà inibitorie della CA-IX [43;44].
64
Il problema principale di questi composti è la ridotta selettività nei confronti delle CA-IX , infatti, essi sono affini anche alle isoforme CA-I e CA-II, le quali svolgono importanti funzioni fisiologiche e di conseguenza si hanno differenti effetti collaterali. A tal proposito, negli ultimi anni, sono nate delle strategie per ottenere composti che agiscano in maniera specifica sulle isoforme associate ai tumori. La principale differenza tra gli isoenzimi CA-IX e XII e gli isoenzimi CA-I e II sta nel fatto che i primi due sono proteine trans membrana che orientano il loro dominio catalitico CA fuori dalla cellula, mentre gli isoenzimi I e II, sono proteine solubili localizzate all’interno della cellula, nel citosol. La strategia che è stata adottata per cercare di ottenere una inibizione selettiva è stata quella di sintetizzare solfonammidi aromatiche con un minore capacità di diffondere attraverso la membrana lipidica. Il primo approccio per indurre l’impermeabilità della membrana agli inibitori della CA, è stato quello di progettare inibitori polimerici ad alto PM. Tuttavia gli effetti in vivo di questi composti sono stati deludenti a causa di problemi connessi ai polimeri (reazioni allergiche o problemi di biodisponibilità).
65
Si è pensato allora di sviluppare solfonammidi altamente polari e saline. Come molecola di riferimento per studi fisiologici è stata utilizzata una solfonammide cationica, la QAS (Quaternary Ammonium Sulfanilamide) che ha dimostrato un elevato effetto inibitorio sulle CA di membrana di vari artropodi e pesci, ma presenta anche un’elevata tossicità per vertebrati più evoluti.[47]
Figura 43. QAS, Quaternary Ammonium Sulfanilamide [45]
Successivamente, a partire dalla molecola QAS, sono stati ottenuti alcuni CAIs (composti 67, 68, 69, 70, figura 44) con affinità nell’ordine del basso nanomolare per le isoforme II e IV. Inoltre, è stato osservato in alcuni studi in vitro su globuli rossi che queste molecole non sono capaci di oltrepassare la membrana citoplasmatica, discriminando in questo modo tra i vari isoenzimi a favore di quelli di membrana. Questa caratteristica è di fondamentale importanza nello sviluppo di inibitori selettivi per le isoforme CA-IX e XII, in quanto esse sono maggiormente espresse sul lato extracellulare della membrana di molte cellule tumorali aggressive, perciò questa classe di composti può rappresentare il punto di partenza per lo sviluppo di nuove teorie antitumorali basate sui CAI[45]
66
67 68: n = 0
69: n = 1 70: n = 2
Figura 44. Sali piridinici inibitori di CA per i quali la membrana citoplasmatica è
impermeabile [45]
Un altro approccio per aumentare la solubilità e tollerabilità del farmaco, è stato quello di inserire parti di carboidrati sulle molecole, ottenendo glicoconiugati. Questa strategia spesso non ha ricevuto una significativa attenzione presso le industrie farmaceutiche, in quanto gli zuccheri riducono la capacità di attraversare le membrane cellulari alle molecole cui sono legati. Tuttavia grazie al successo del “tail approach” per lo sviluppo di potenti CAIs, Wilkinson et al, hanno deciso di legare delle code di carboidrati al farmacoforo ad elevata affinità Ar-SO2-NH2,
sintetizzando delle solfonammidi benzeniche glicoconiugate, al fine di rendere tali molecole selettive per gli isoenzimi di membrana CA-IX e –XII.[46] Due composti (71-72) si sono rivelati molti attivi e selettivi verso la CA-IX grazie alla presenza della code zuccherine. Come detto in precedenza, poiché l’ipossia è una caratteristica di molti tumori solidi, un’altra strategia per colpire gli isoenzimi associati ai tumori, è la progettazione di inibitori della CA bioriduttivi, ipossia- attivabili (73-74).
67
Figura 45. (A) benzensolfonammidi glucoconiugate [46] (B) Profarmaco
bioriduttivo ipossia-attivabile e formazione di un tiolo derivante dalla scissione in vivo del legame disolforico a seguitodi riduzione
La strategia è quella di utilizzare le condizioni di riduzione presenti in tali tumori, dove l’ossigeno è meno dell’1%, per convertire un profarmaco inattivo in un inibitore della CA. Questo tipo di riduzione, può essere mediata, dalla proteina riducente tioredoxina-1, che è stata trovata ad alte concentrazioni in molti tipi di tumore umano. Quindi, sono stati sintetizzati derivati disolfurici delle solfonammidi eterocicliche aromatiche da De Simone e colleghi [47]. Inizialmente, tali solfonammidi erano molto ingombranti e quindi incapaci di legarsi all’interno dello spazio ristretto del sito attivo della CA. La bioriduzione nei tumori ipossici di tali solfonammidi dimeriche dovrebbe generare tioli, che quindi molto meno
68
voluminosi e dovrebbero legarsi al sito attivo degli enzimi associati al cancro, presenti nei tumori ipossici.
5.2 Inibitori dell’Anidrasi Carbonica utilizzati come
markers tumorali nella diagnosi del cancro
Le CA-IX e XII sono espresse nelle cellule tumorale e possono essere utilizzati come marcatori per un ampio spettro di tumori solidi ipossici. Sono state progettate alcune solfonammidi fluorescenti per l’imaging e la successiva diagnosi di tumori. Uno dei più importanti composti sintetizzati è il derivato 75 (4- sulfamoilfeniletiltioureido) fluoresceina, preparato attraverso la reazione della fluoresceina tiocianato (FITC) con una omosulfanilammide aromatica ammino sostituita. E’ stato dimostrato che il composto 75 lega solo il tessuto tumorale ipossico, sovraesprimendo gli isoenzimi associati al cancro. Questo composto presenta una Ki verso la CA IX di 24 nM e mostra proprietà di impermeabilità alla membrana. [48]
75
Figura 46. Preparazione della solfonammide fluorescente 75 utilizzata come
69
Introduzione alla parte
sperimentale
70
Le Anidrasi Carboniche (CA) sono una superfamiglia di metallo enzimi, soprattutto Zn-enzimi, che catalizzano la conversione della CO2 a ione bicarbonato:
CO2 + H2O ↔ HCO3- + H+
Le CA sono coinvolte in molti processi fisiologici e fisiopatologici, tra cui:
• la respirazione e il trasporto di CO2 e bicarbonato tra i tessuti
metabolizzanti e i polmoni; • l’omeostasi del pH e della CO2;
• la secrezione di elettroliti in vari tessuti e organi;
• diverse reazioni biosintetiche (gluconeogenesi, lipogenesi e urogenesi), • il riassorbimento osseo e calcificazione;
• la tumorigenicità. [13;49]
Si tratta di enzimi ubiquitari presenti nei procarioti e negli eucarioti, codificati da sei famiglie di geni di diversa evoluzione: α-CA, β-CA, γ-CA, δ-CA, ζ-CA, η-CA. Nei mammiferi sono stati descritti 15 differenti isoforme di α-CA, con diversa attività catalitica; esistono cinque forme citosoliche (CA-I, CA-II, CA-III, CA-VII e CA-XIII), cinque forme transmembrana (CA-IV, CA-IX, CA-XII, CA-XIV e CA- XV), due forme mitocondriali (CA-VA e CA-VB) e un isoenzima secreto nella saliva (CA-VI).
La presenza delle CA in così tanti tessuti e in così tante isoforme rappresenta uno stimolo per la progettazione di inibitori con diverse applicazioni biomediche. Molti inibitori delle CA (CAI) sono risultati efficaci dal punto di vista clinico e negli ultimi anni sono emerse nuove applicazioni. Essi possono essere utilizzati come farmaci antiglaucoma, antiobesità, diuretici, anticonvulsivanti, antinfettivi, agenti antitumorali e come strumenti diagnostici.[29]
Le più importanti classi di CAI sono due: gli anioni complessanti il metallo (come i carbossilati) e le solfonammidi/sulfamati/sulfammidi, che generalmente si legano allo ione Zn2+ del sito attivo dell’enzima. Di recente, sono state descritte alcune strategie di progettazione di farmaci che combinano il cosiddetto “tail approach”
71
con innovative tecniche di cristallografia a raggi X ad alta definizione, per ottenere
nuove classi di CAI con le opportune proprietà fisico-chimiche e farmacologiche[4].
L’obiettivo è quello di ottenere solfonammidi/ditiocarbammati, che, sfruttando regioni di legame più esterne rispetto al sito attivo dell'enzima, forniscono così
composti isoforma-selettivi. Grazie all’utilizzo di queste due metodiche, nel
laboratorio presso il quale è svolto il presente lavoro di tesi, sono stati sviluppati nuovi derivati triciclici caratterizzati da uno scaffold benzotiopiranopirazolico e piridotiopiranopirazolico sul quale è inserita una funzione benzensolfonammidica (composti 76 a-e, figura 47).[50] Questi composti erano stati progettati come
analoghi rigidi di Celecoxib (CLX ) e Valdecoxib (VLX), inibitori specifici delle ciclossigenasi 2 che hanno dimostrato di essere anche potenti inibitori della CA.
N N CF3 S H3C O O NH2 O N H3C S O O NH2 S N N X R S O O H2N CLX VLX 76 a-e 76a: X = CH R = OCH3 76b: X = CH R = Cl 76c: X = CH R = CF3 76d: X = N R = H 76e: X = N R = CH3
Figura 47.Celecoxib (CLX) , Valdecoxib (VLX), derivati bezotiopiranopirazolici
72
I composti 76a-e, così come i composti CLX e VLX sono stati saggiati quali inibitori catalitici delle isoforme umane hCA I-XIV presso il laboratorio del Professor Supuran C. T. dell’Università di Firenze ed i dati ottenuti sono stati riportati in Tabella 6.
Tabella 6 Profilo di inibizione delle 15 isoforme umane di CAs da parte dei
73
La caratteristica principale dei derivati 76a-e, è risultata l’elevata capacità di inibire le hCA I e II, mentre l’attività inibitoria nei confronti di hCA III, IV, VA, VB, VI, VII, IX, XII, XIII e XIV è risultata di due ordini di grandezza più bassa [51]:
La cristallografia a raggi X e studi di sovrapposizione hanno permesso di razionalizzare questa selettività del profilo di inibizione delle pirazolo- solfonammidi, che è risultato piuttosto differente da quello dei composti di riferimento celecoxib e valdecoxib. In particolare, sono stati condotti studi di cristallografia a raggi X sul composto risultato più attivo, 76e, complessato con l’enzima hCA II (figura 48)
Figura 48 Rappresentazione schematica del complesso formato dal composto 76e
(di colore rosa) col sito attivo di hCA-II. Lo ione zinco nel sito attivo è rappresentato
come una sfera grigia[50].
Da questo studio, è risultato che il composto 76e si posiziona in profondità nella tasca del sito attivo dell’enzima, per cui l’azoto della solfonammide si lega direttamente allo ione zinco. L’atomo di zolfo dello scaffold, invece, rimane fuori dal sito attivo e non è direttamente coinvolto in nessuna interazione con l’enzima producendo solo una distorsione nella geometria del nucleo triciclico.
Gli anelli idrofobici del sistema eterociclico si protendono all’esterno e sono stabilizzati principalmente da residui idrofobici che delimitano la cavità del sito attivo coinvolgendo interazioni di Van der Waals con le catene laterali di Valina 121, Fenilalanina 131, Leucina 198, Prolina 202 ed Istidina 64. Inoltre, dall’analisi
74
sugli studi di sovrapposizione del complesso CA-II/76e con le strutture cristalline di CA-I, II e XII, sono stati evidenziati i residui amminoacidici che determinano una riduzione dell’idrofobicità nelle tasche all’interno del sito attivo di CA-IX e XII rispetto agli amminoacidi corrispondenti in CA-I e II. Questi potrebbero essere i responsabili delle diverse affinità del composto 76e nei confronti delle diverse isoforme di CA.
Le benzensolfonammidi 76a-e, costituiscono quindi una classe di farmaci molto interessante poichè hanno la capacità di inibire solo un numero limitato di isoforme fisiologicamente rilevanti di CA. La maggior selettività di inibizione porta al vantaggio che tali inibitori daranno sicuramente meno effetti collaterali rispetto a quelli di vecchia generazione non selettivi.
La ricerca in questo ambito è continuata investigando altre serie di composti benzensolfonammidici apportando delle modifiche allo scaffold dei derivati 76a-e, sempre con lo scopo di sintetizzare CAI isoforma-selettivi.
In particolare, la porzione benzensolfonammidica dei composti 76a-e è stata shiftata dalla posizione 1 alla posizione 2 del sistema pirazolico, ottenendo i composti 77a-d (figura 49). Sono stati inseriti nella posizione 7 (R) i sostituenti che avevano mostrato i migliori risultati negli studi effettuati sui composti precedentemente descritti 76 a-e [52] (CH3, Cl, OCH3).
77 a-d
77a: X = CH, R = OCH3
77b: X = CH, R = Cl 77c: X = N, R = H
77d: X = N, R = CH3
Figura 49 Composti 77a-d nei quali la benzensolfonammide si trova in posizione
75
Contemporaneamente, sono stati studiati composti con uno scaffold etero- policiclico di tipo benzotiopiranopirimidinico e piridotiopiranopirimidinico, strutturalmente correlati, omologhi superiori del nucleo pirazolico dei composti 76 e 77. In particolare, è stata effettuata la sintesi dei composti 78a-e decorati con una funzione benzensolfonammidica in posizione 2 del sistema triciclico spaziato da un
linker NH (figura 50). 78 a-e 78a: X = CH, R = H 78b: X = CH, R = OCH3 78c: X = CH, R = Cl 78d: X = N, R = H 78e: X = N, R = CH3
Figura 50 Composti 78a-e caratterizzati da un nucleo benzotiopiranopirimidinico (78a-c) e piridotiopiranopirimidinico (78d-e) nei quali la benzensolfonammide si
trova legata in posizione 2 del sistema pirimidinico mediante un linker NH[52].
I composti 77a-d e 78a-e sono stati saggiati per la loro capacità inibitoria enzimatica contro quattro isoforme di CA fisiologicamente rilevanti, la CA-I, -II - IX e -XII, utilizzando l’acetazolamide (AAZ) come composto inibitore di riferimento (tabella 7).
76
Tabella 7 Profilo di inibizione dei composti 77a-d e 78a-e
77a-d 78a-e
I dati raccolti in Tabella 7 evidenziano che i composti 77a-d inibiscono significativamente tutte e quattro le isoforme investigate, con costanti di inibizione, rispettivamente, nel range di 22.5-68.4 nM verso l’isoforma umana I, 7.1-8.5 nM
N X R
Ki*(nM)
hCA-I hCA-II hCA- IX hCA-XII 77° CH Cl 41.5 8.5 6.1 68.6 77b CH OCH3 68.4 7.4 7.4 38.1 77c N H 22.5 7.1 6.3 66.7 77d N CH3 37.1 7.6 7.7 62.5 78° CH H 80.5 96.0 7.0 75.1 78b CH OCH3 66.9 63.2 22.5 48.9 78c CH Cl 84.0 218 8.7 15.5 78d N H 68.3 9.4 27.6 17.8 78e N CH3 68.9 8.0 8.1 34.4 1 - - 250 12 25 5.6
77
verso l’isoforma II, 6.1-7.7 nM verso l’isoforma IX, 38.1-68.6 nM verso l’isoforma XII. Dagli studi di relazione struttura-attività (SAR) è emerso che il sostituente R, così come l’eteroatomo X, hanno una scarsa influenza sull’attività inibitoria. È dunque risultato che lo shift del gruppo benzensolfonammidico dalla posizione 1 alla posizione 2 dell’anello pirazolico, determina una perdita dell’isoforma-
selettività di questi composti[52]. La ricerca si è quindi focalizzata su nuovi inibitori
che incorporano un anello pirimidinico sul sistema benzotiopirano e piridotiopirano (78a-e). Come emerge dai dati riportati in Tabella 7, l’isoforma citosolica CA-I è
inibita moderatamente da tutti i composti 78a-e con una Ki compresa tra 66.9 e 84.0
nM; nuovamente gli studi di SAR hanno mostrato che la natura del sostituente R e/o dell’eteroatomo X non hanno un’influenza significativa ai fini dell’attività biologica. Questo non è invece il caso dell’isoforma CA-II, per la quale si evidenzia un differente profilo di inibizione da parte dei composti 78a-e. In particolare, i
composti 78d e 78e si sono mostrati efficaci inibitori di questa isoforma con una Ki
compresa tra 8.0 e 9.4 nM. Al contrario, l’Acetazolamide 1, standard di riferimento,
ed i composti 78a-c sono risultati molto meno efficaci, con valori di Ki assai più
elevati (63.2-218 nM). La migliore sostituzione si è, dunque, dimostrata quella che incorpora nello scaffold policiclico l’anello piridinico. Per quanto riguarda l’isoforma transmembranale IX, un valido target antitumorale, essa è risultata
essere inibita in modo efficace, con valori di Ki che vanno da 7.0 a 27.6 nM, sia dai
derivati con l’anello benzenico (78a-c), che da quelli con l’anello piridinico (78d-
e) fusi nel sistema triciclico.
Anche per quanto riguarda l’isoforma XII, tali composti si sono dimostrati dei validi
inibitori con valori di Ki nel range 15.5 e 75.1 nM. In particolare, i composti più
efficaci si sono dimostrati 78c (R = Cl) nella serie benzenica e 78d (R = H) nella serie piridinica.
Sulla base delle ricerche fin qui discusse, sono state progettate ulteriori modifiche allo scaffold triciclico dei sistemi appena descritti con l’obiettivo di individuare nuovi potenti CAI isoforma-selettivi. A questo proposito, sono state studiate tre piccole serie di composti polieterociclici 79, 80 e 81 caratterizzati dalla funzione benzenesolfonammidica primaria, fondamentale per il legame allo ione metallico nel sito attivo enzimatico (figura 51). In particolare, in tutte le nuove classi, l’atomo
78
di zolfo è stato sostituito con il bioisostero gruppo metilenico, dal momento che gli studi condotti in precedenza avevano evidenziato che l'atomo di zolfo non era necessario per l'interazione di con l'enzima[50].
79a-c 80a-c 81a-c 79a: R = H 79b: R = CH3 79c: R = C6H5 80a: R1 = R2 = H 80b: R1 = R2 = CH3 80c: R1 = C6H5, R2 = H 81a: R1 = R2 = H 81b: R1 = R2 = CH3 81c: R1 = C6H5, R2 = H
Figura 51 Benzensolfonammidi primarie in cui l’atomo di zolfo dell’anello
tiopiranico dello scaffold è stato sostituito dal bioisosterico gruppo metilenico [53].
Le benzensolfonammidi 79a-c (Figura 51) mantengono un sistema triciclico 5,6,6 analogo ai derivati 76 e 77, ma presentano un ulteriore atomo di azoto nel nucleo piridinico (che diventa pirimidinico); questo atomo di azoto aggiuntivo potrebbe eventualmente costituire un ulteriore o alternativo punto di interazione con l'enzima.
I derivati biciclici con scaffold tetraidroindazolico (80a-c, figura 51) e tetraidrochinazolico (81a-c, figura 51) sono stati invece concepiti come una semplificazione strutturale dei composti delle serie 76 e 78, rispettivamente, in cui la porzione fenil- e pirido-fusa è stata rimossa ed è stato aggiunto un gruppo carbonilico sull'anello non aromatico. La funzione benzensolfonammidica, fondamentale per l’attività, è stata mantenuta, direttamente legata alla posizione 1 del nucleo pirazolico (80a-c, figura 51) o in posizione 2 di quello pirimidinico spaziata mediante un linker NH (81a-c, figura 51), in rigorosa analogia con i
79
derivati 76 e 78, rispettivamente. Infine, tutti i composti triciclici 79a-c e i derivati biciclici 80a-c e 81a-c sono stati decorati in posizione 6 con gruppi metilici o
fenilici (R, R1 e R2) per valutare l'effetto di questi sostituenti sull'efficacia e
selettività verso i vari isoenzimi [53].
Tutti i nuovi composti sintetizzati 79a-c, 80a-c e 81a-c sono stati studiati per la loro capacità inibitoria enzimatica sulle quattro isoforme di CAs fisiologicamente rilevanti: hCA-I, -II, -IV e -IX, utillizzando ancora Acetazolamide 1 come
riferimento [54], tabella 8.
Tabella 8 Profilo di inibizione di 79a-c, 80a-c e 81a-c verso la hCA-IX e livello di
selettività verso tale isoforma comparato con hCA-I, -II e -IV[53].
80
Da un punto di vista generale, i dati riportati nella Tabella 8 mostrano che la sostituzione bioisosterica dell’atomo di zolfo con un gruppo metilenico porta a potenti CAI, confermando le precedenti ipotesi sull'assenza di un coinvolgimento diretto dello zolfo nell'interazione con l’enzima. Tutti i composti, inoltre, sono inibitori altamente efficaci verso l’isoforma associata al tumore hCA-IX, mostrando
livelli di potenza nel range basso nanomolare/subnanomolare (intervallo Ki da 7.3
a 0.55 nM), con un evidente incremento di attività rispetto al riferimento 1 (Ki 25.8
nM). L’isoforma citosolica hCA-I risulta inibita moderatamente dai composti 79-
81, mentre si osservano diversi profili di attività nei confronti degli isoenzimi II e
IV. Si evince quindi, che tutti i derivati agiscono come inibitori preferenziali di hCA-IX, con rapporti di selettività che vanno da 61.3 a >1370 rispetto a hCA-I, da
7.12 a 577 rispetto a hCA-II, e da 1.8 a 359 rispetto a hCA-IV[53].
Inoltre, i risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli ottenuti per i composti
76d-e che, finora, hanno fatto registrare i dati più promettenti dal punto di vista
dell’attività e selettività nei confronti dell’anidrasi carbonica (hCA-II).
In particolare, il passaggio dallo scaffold piridotiopiranopirazolico di 76d-e allo
scaffold pirazolodiidrochinazolinico di 79a-c produce una modifica nel profilo di
inibizione di hCA, che diventa variabile e dipendente dal sostituente in posizione 7. Il composto non sostituito 79a mostra un incremento di attività verso tutte le isoforme saggiate, ma, in particolare per l'isoforma CA-IX; al contrario, l'inserimento di un gruppo 7-metilico o 7-fenilico (composti 79b-c), causa una leggera diminuzione della potenza di inibizione per hCA-IX (79a, Ki 0.57 nM; 79b,
Ki 7.0 nM; 79c, Ki 7.3 nM). Tuttavia, il sostituente 7-fenilico conferisce un’alta
selettività nei confronti dell’isoforma hCA-IX rispetto alle altre hCA saggiate. Tutti i composti caratterizzati da uno scaffold semplificato (80b-c e 81a-c), indipendentemente dalla sostituzione del nucleo centrale sono risultati potenti inibitori dell’isoforma CA-IX, con valori Ki di nel range del subnanomolare
(compresi tra 0.55 e 0.89 nM), con la sola eccezione di 80a (Ki 5.2 nM). Le isoforme
hCA-I e -II sono scarsamente (hCA-I) o efficacemente (hCA-II) inibite dai composti 80-81 (con valori di Ki compresi tra 272.2 e 746.3 nM per l’isoforma I e
tra 5.2 e 8.6 nM per l’isoforma II); la sola eccezione a questa tendenza riguarda i composti 81a (con una Ki di 63.9 nM nei confronti di hCA-I) e 80a (con una Ki di
81
78.2 nM per hCA-II), mentre valori di Ki più variabili sono stati riscontrati per
l’isoforma legata alla membrana hCAIV[53]. Per razionalizzare l’attività e la
selettività dei nuovi composti, sono stati condotti studi di molecular docking per i ligandi 79c, 80c e 81c, scelti come composti rappresentativi delle tre serie. I risultati ottenuti hanno rivelato che 79c, 80c e 81c chelano lo Zn(II) nel sito attivo attraverso l’atomo di azoto caricato negativamente della porzione benzensolfonammidica, analogamente a quanto osservato per le altre solfonammidi. Inoltre, la solfonammide in ciascun composto è ben posizionata per formare un legame a idrogeno con il gruppo NH di T200. Oltre a queste interazioni condivise fra le molecole saggiate, la diversa struttura dello scaffold dei tre CAI selezionati produce diversi modelli di interazione con il resto della struttura proteica dell’enzima.
Figura 52. Complesso 79c/hCA-IX. La molecola di inibitore è rappresentata in
colore arancio disposta all’interno della tasca del sito attivo sul fondo della quale è
alloggiato l’atomo di Zn(II) rappresentato da una sfera grigia [53]
Il composto 79c (in Figura 52) adotta una conformazione in cui i due atomi di azoto dell'anello pirimidinico accettano un doppio legame ad idrogeno dalle catene laterali Q71 e Q92. Presumibilmente, la forte attrazione data dalla doppia interazione del legame idrogeno potrebbe spiegare l'alta affinità di 79c per hCA-IX.