Biochimica e meccanismo d’azione del sistema monoossigenasico citocromo P450-dipendente

Le reazioni di ossidazione controllate dal sistema monoossigenasico citocromo P450-dipendente sono molteplici, ma possono riconoscere tutte alla loro base un processo di idrossilazione/monoossigenazione del substrato che richiede un agente riducente (NADPH) e ossigeno molecolare (O2):

NADPH + O2 + RH + H+

→

In una reazione tipica viene consumata una molecola di O2 per ogni

molecola di substrato: un atomo di ossigeno è incorporato in quest’ultimo mentre l’altro è ridotto ad acqua dai due equivalenti riducenti (2 H+ e 2 elettroni) condotti dal NADPH citosolico alle diverse isoforme di CYP attraverso l’unica forma di NADPH citocromo P450 reduttasi (fig. 2.16).

Figura 2.16. Catena di trasporto elettronico microsomiale.

In particolare (fig. 2.17), la catalisi enzimatica inizia con il legame del substrato nel sito attivo della forma ossidata del CYP (Fe3+), che, a riposo, lega una molecola d’acqua nel sesto sito di coordinazione (1). I

processi di desolvatazione e di legame del substrato sono accompagnati da un cambiamento conformazionale e da un aumento del potenziale redox del CYP che facilitano rispettivamente l’interazione con la reduttasi e il trasferimento elettronico. Il CYP viene quindi ridotto allo stato ferroso (Fe2+) dal primo elettrone della coppia fornita dal NADPH attraverso la NADPH citocromo P450 reduttasi (2). Il complesso substrato-citocromo ridotto incorpora una molecola di ossigeno nel sesto sito di coordinazione dell’eme (3) formando il complesso Fe2+- O2 (3) in equilibrio con la specie Fe3+-

O2– (4). A questo punto interviene il secondo elettrone messo a

disposizione dal NADPH. Il risultato della seconda riduzione è la formazione del complesso Fe2+- O2 – (5) in equilibrio con la forma

Fe3+- O22– (6). L’ossigeno di quest’ultima reagisce con 2 H+

generando una molecola d’acqua e il complesso FeO3+ (7). L’ossigeno di quest’ultimo è altamente reattivo e sottrae al substrato un atomo di idrogeno generando il radicale R• (8). Il gruppo –OH che si è formato nel core catalitico del CYP reagisce successivamente con il radicale R• che viene così idrossilato (9) e rilasciato a favore di una nuova molecola di acqua (10) (Lewis, 2003).

La NADPH citocromo P450 reduttasi coordina il trasporto dei due equivalenti riducenti attraverso i cofattori flavinici FAD e FMN che rappresentano rispettivamente il sito accettore e donatore dei due elettroni provenienti dal NADPH e diretti al ferro eminico: i due equivalenti riducenti vengono trasferiti uno per volta al centro catalitico del CYP grazie alla capacità della reduttasi di stabilizzare la forma semichinonica dei due cofattori flavinici (fig. 2.18) (Gutierrez e altri, 2003).

La capacità di intervenire su numerosissimi substrati rende il sistema monoossigenasico in grado di catalizzare svariati tipi di reazioni di ossidazione:

• idrossilazione alifatica e aromatica: è la più comune e meglio compresa reazione catalizzata dal sistema. L’idrossilazione

Figura 2.17. Ciclo catalitico del sistema monoossigenasico citocromo P450-dipendente. In rosso sono indicate le specie reattive dell’ossigeno (ROS) che possono essere rilasciate durante la reazione.

Figura 2.18. Ciclo redox della NADPH citocromo P450 reduttasi.

alifatica consiste nell’inserzione su di un carbonio non aromatico di un ossidrile a livello del legame C-H. Quella aromatica si verifica invece per aggiunta di ossigeno su un doppio legame del sistema aromatico con la formazione di un

epossido che si riarrangia spontaneamente a ossidrile. Conseguentemente all’idrossilazione si può verificare: a) una reazione di dealchilazione (rilascio di eteroatomi N, O e S) che risulta dall’idrossilazione di un atomo di carbonio adiacente all’eteroatomo e porta alla formazione di un intermedio instabile in cui si verifica la rottura del legame C-eteroatomo; b) una reazione di dealogenazione ossidativa che rappresenta la via di trasformazione dei composti alogenati lipofili. Il meccanismo della reazione prevede il legame di un ossigeno sul carbonio alogenato dopo sottrazione di un radicale idrogeno o di un elettrone all’alogeno: si ha la formazione di un intermedio X-C-OH che si decompone rilasciando un carbonile e l’alogeno sottoforma di XH;

• ossigenazione di eteroatomi (N, S, P ed I): consiste nel trasferimento di un ossigeno o di un ossidrile ad una coppia di elettroni liberi dell’eteroatomo. E’ una reazione che risente fortemente dell’elettronegatività di quest’ultimo: una maggiore elettronegatività si traduce in una minor reattività dell’eteroatomo stesso;

• epossidazione: si tratta della conversione delle olefine nei rispettivi epossidi che si verifica come conseguenza dell’inserzione di un atomo di ossigeno ad un doppio legame tra due atomi di carbonio.

Unitamente alle summenzionate ossidazioni, il sistema monoossigenasico catalizza una serie di reazioni “inusuali” che comprendono:

• riduzione: si tratta di reazioni che si verificano in condizioni di carenza di ossigeno. Riguardano principalmente composti azo, nitro, aromatici e alogenati (che subiscono così dealogenazione). Il sistema monoossigenasico non riduce solo molecole organiche ma anche inorganiche come l’SO2 e CrVI;

• desaturazione: consiste nella rimozione di due atomi di idrogeno dal substrato con formazione di un doppio legame.

Dal punto di vista elettronico è equivalente a una reazione di idrossilazione in quanto consiste in un’ossidazione bielettronica;

• scissione ossidativa di esteri: consiste nell’introduzione di un ossigeno sul gruppo uscente con conseguente rilascio di un acido carbossilico e di un aldeide;

• espansione e formazione di anelli: si tratta di reazioni in cui il prodotto si riarrangia a formare sistemi penta- o esaciclici maggiormente stabili e si assiste alla generazione di anelli assenti prima della catalisi, rispettivamente;

• deidratazione: consiste nella sottrazione di una molecola di acqua al substrato, principalmente aldossime convertite a nitrili;

• riarrangiamenti di idroperossidi di acidi grassi e

prostaglandine: come dice il nome stesso sono reazioni di

riarrangiamento e di solito non coinvolgono l’intervento di fonti elettroniche esterne;

• isomerizzazioni: consistono nel cambiamento dall’orientazione cis alla trans e viceversa dei sostituenti di un substrato.

A queste bisogna aggiungere ossidazioni monoelettroniche, la

scissione di aldeidi ed un’attività di fosfolipasi D (Guengerich,

2001).

Come è possibile notare (fig. 2.17), il ciclo catalitico alla base delle numerose reazioni di ossidazione catalizzate dal sistema monoossigenasico è una possibile fonte di stress ossidativo: può rilasciare infatti il radicale substrato (R•) unitamente a ROS come l’anione superossido (O2•-) e il perossido di idrogeno (H2O2) che a loro

Figura 2.19. Specie reattive dell'ossigeno (ROS).