La struttura dei CYP e della NADPH citocromo P450 reduttas

Nonostante la grande quantità di CYP che si sono evoluti, l’ampio numero di substrati riconosciuti e un’identità di sequenza non superiore al 10-30%, i CYP presentano domini proteici, elementi di struttura secondaria e ripiegamento terziario piuttosto conservati.

Tutti i CYP sono proteine transmembrana di 400-500 aminoacidi dotate di un’unica lunga α elica N-terminale che ancora la proteina alla membrana del REL e di un core catalitico che sporge nel citoplasma (fig 2.8).

Figura 2.8. L'α elica N-terminale (in verde) ancora i CYP nella matrice fosfolipidica del REL mentre il core catalitico (in blu e arancione) sporge nel citoplasma cellulare. La reduttasi è caratterizzata da un’organizzazione strutturale molto simile.

Il core catalitico presenta elementi di struttura secondaria α e β che vengono contraddistinti da lettere latine (A-L) e lettere greche seguite da numeri, rispettivamente (fig. 2.9) (Degtyarenko, 1995).

Figura 2.9. Allineamento della sequenza di 9 diversi CYP. Al di sopra delle sequenze sono riportati gli elementi di struttura secondaria α e β, indicati consecutivamente a partire dall'N-terminale con lettere latine e lettere greche seguite da numeri, rispettivamente; al di sotto sono mostrate le SRS numerate da 1 a 6.

Tali α-eliche e foglietti β sono organizzati a formare una struttura globulare di forma triangolare altamente conservata tra tutti i CYP.

Per convenzione, a tale struttura globulare sono state attribuite due facce:

• la faccia distale: è la porzione di proteina che si trova di fronte al sesto sito di coordinazione occupato, durante la catalisi, da ossigeno molecolare che, insieme al NADPH, costituisce l’elemento fondamentale per la reazione di ossidazione;

• la faccia prossimale: è la parte di proteina di fronte al quinto sito di coordinazione occupato dall’atomo di zolfo di un residuo di cisteina altamente conservato.

Fra queste due superfici giace il gruppo eme che è coordinato sul versante distale dall’α elica I mentre su quello prossimale dall’α elica L che è preceduta dalla sequenza consenso FXXGXXXCXG contenente il residuo di cisteina (altamente conservato) che occupa il 5 sito di coordinazione dell’eme.

La superficie distale (fig. 2.10) rappresenta il sito di interazione con il substrato che, in tal modo, si viene a trovare in prossimità dell’ossigeno e può essere facilmente idrossilato.

I substrati vengono posizionati nel sito attivo da diverse porzioni della catena polipeptidica. Tali parti sono definite siti di riconoscimento del substrato (SRS) e in ciascun CYP sono numerate da 1 a 6 (fig. 2.9): l’SRS1 è situata tra le eliche B’ e C, l’SRS2 e l’SRS3 si trovano rispettivamente in corrispondenza dell’elica F e G, l’SRS4 è posizionata a ridosso dell’elica I, l’SRS5 si trova tra i foglietti β6-1 e β1- 4, l’SRS6 cade fra i foglietti β4-1 e β4-2. Nel complesso, le SRS danno

origine ad una cavità ampia, di natura idrofobica e ben infossata all’interno del core catalitico (fig. 2.11) (Johnson, 2003).

Figura 2.11. Faccia distale del CYP2C5 in cui sono mostrate in arancione le SRS che formano di fronte al sesto sito di coordinazione dell’eme (in rosso) la cavità per il legame del substrato.

Le SRS sono delle regioni molto flessibili, sia per ciò che riguarda la sequenza che la loro collocazione spaziale, e tale caratteristica rende ragione dell’ampia specificità di substrato dei CYP, delle diverse cinetiche di reazione tra isoforme che riconoscono gli stessi substrati e

delle diverse regio- e stereoselettività con cui viene effettuata la reazione di ossidazione da parte di diversi CYP (Danielson, 2002). La faccia prossimale (fig. 2.12), al contrario di quella distale, è strutturalmente più conservata in quanto è deputata all’interazione con la NADPH citocromo P450 reduttasi. A tale scopo, su questo versante dei CYP, il gruppo eme risulta essere più esposto.

Figura 2.12. Faccia prossimale del CYP2C5 coinvolta nel legame della NADPH citocromo P450 reduttasi.

Nell’interazione fra i due partners redox gioca un ruolo fondamentale l’α elica C (fig. 2.12): quest’ultima infatti è carica positivamente (lisine e arginine) e interagisce elettrostaticamente (e idrofobicamente) con uno dei domini, quello di legame per l’FMN, della reduttasi carico invece negativamente (aspartato e glutammato) (fig. 2.13) (Scott e altri, 2004).

Figura 2.13. Interazione elettrostatica tra i CYP e la reduttasi. Sulla destra è mostrato un possibile modello di contatto tra le 2 proteine in cui il CYP (in bianco) lega frontalmente la reduttasi (in blu e fuxia).

Come si può notare dalla figura precedente (fig. 2.13), anche la reduttasi è dotata di due regioni principali: una porzione idrofobica N- terminale di 6 kDa che ancora la proteina alla matrice fosfolipidica del REL e partecipa alla corretta interazione con i CYP e il core catalitico C-terminale di 72 kDa che sporge nel citoplasma (fig. 2.8).

Quest’ultimo è costituito, dall’N- al C-terminale, da quattro domini principali:

• il dominio di legame per l’FMN; • un dominio di connessione; • il dominio di legame per il FAD;

• il dominio di legame per il NADPH (fig. 2.14).

Figura 2.14. Diagramma dell'organizzazione dei quattro domini della NADPH citocromo P450 reduttasi. Il dominio di connessione è mostrato in verde e i numeri indicano la posizione dei diversi domini lungo la sequenza aminoacidica della proteina.

Il dominio FMN, come anticipato precedentemente, è il sito di interazione con le diverse isoforme di CYP e lega il cofattore flavinico all’estremità C-terminale della struttura α/β che lo costituisce. Il dominio FAD presenta invece un’organizzazione β e lega il cofattore flavinico in una conformazione estesa con la porzione isoallossazinica posizionata al confine tra i domini FAD e NADPH e il resto della molecola posto all’interfaccia tra il dominio FAD e di connessione (fig. 2.15). Tale conformazione fa sì che i due cofattori flavinici si trovino l’uno di fronte all’altro ed a una distanza tale da garantire il passaggio degli elettroni in modo diretto senza l’interazione di alcun residuo aminoacidico, ma piuttosto del dominio di connessione, una struttura α la cui funzione principale è quella di mantenere un corretto posizionamento del dominio FMN e FAD. Il dominio NADPH è situato sul lato opposto della regione di ancoraggio alla membrana ed è conformato in modo tale da consentire in modo agevole il transito del nucleotide piridinico da e verso il citoplasma (Wang e altri, 1997).

Figura 2.15. Organizzazione strutturale della NADPH citocromo P450 reduttasi. In blu è mostrato il dominio FMN, in rosa il dominio di connessione e in verde il dominio FAD e NADPH. L'FMN è mostrato in giallo, il FAD in rosso e il NADPH il arancione.

2.4.4 Biochimica e meccanismo d’azione del sistema