Fonti di ROS

Negli organismi viventi un innalzamento dei livelli di ROS si può verificare come conseguenza dell’aumento dell’attività metabolica cellulare, tuttavia anche agenti esterni possono determinarne un incremento.

Fra le fonti endogene si possono individuare almeno sei siti: la plasmamembrana, la membrana nucleare, i mitocondri, i perossisomi, il reticolo endoplasmico liscio (REL) ed il citosol.

La plasmamembrana rappresenta una delle fonti più importanti di ROS, particolarmente (ma non esclusivamente) nei leucociti polimorfonucleati (PMN). Nella membrana plasmatica di queste cellule, infatti, sono localizzati diversi enzimi, quali la NADPH ossidasi e le lipoossigenasi: la loro attivazione in seguito a infezione, infiammazione o reazioni immunopatogene si accompagna alla produzione di metaboliti fortemente ossidanti nell’ambito del

respiratory burst. Mentre la NADPH ossidasi catalizza la formazione

di anione superossido (O2•¯) da ossigeno molecolare e NADPH

(NADPH + 2O2 NADP+ + H+ + 2O2•¯), il sistema delle

lipoossigenasi genera dall’acido arachidonico intermedi metabolici con caratteristiche di perossidi (Valko e altri, 2004).

Oltre ai suddetti enzimi, fa parte del potenziale battericida di neutrofili PMN e monociti l’enzima mieloperossidasi (MPx): localizzato nei granuli azzurrofili delle stesse cellule, in seguito alla loro attivazione la MPx viene riversata all’esterno dove catalizza la produzione di acido ipocloridrico (HOCl), un potente ossidante, a partire dallo ione cloruro (Cl¯) e dal perossido di idrogeno (H2O2) (fig. 4.1) (Dale e

altri, 2008).

Vi è da precisare che la NADPH ossidasi espressa dai PMN fa parte di una più ampia famiglia di ossidasi denominata Nox. Tali enzimi rappresentano per i tessuti nei quali sono espressi (colon, pelle, endotelio, muscoli, cuore, tiroide, orecchio, ecc…) una fonte di ROS: tutti e sette i membri della famiglia (Nox1-5 e Duox1 e 2), infatti, veicolano attraverso la membrana plasmatica gli equivalenti riducenti provenienti dal NADPH per ridurre l’O2 a O2•¯ e/o H2O2 (Bedard e

Krause, 2007).

Le membrane nucleari contengono citocromo ossidasi e sistemi di trasporto degli elettroni che sembrano simili a quelli dell’REL, ma la cui funzione non è ancora ben nota. Si suppone che la fuga degli elettroni da questi sistemi enzimatici possa portare alla formazione di ROS responsabili in vivo dei danni al DNA (Halliwell e Gutteridge, 1999).

I mitocondri rappresentano la fonte metabolica primaria di ROS perché sulle loro creste sono localizzati i complessi enzimatici della catena respiratoria deputati alla fosforilazione ossidativa. Idealmente, il trasferimento di elettroni (riduzione tetravalente) da NADH e/o FADH2 all’ossigeno molecolare dovrebbe concludersi con la

produzione di H2O.

Questo processo tuttavia non è perfetto. E’ stato infatti stimato che circa l’1-5% dell’ossigeno presente nei mitocondri può essere ridotto direttamente da elettroni che sfuggono alla catena respiratoria a monte del Complesso IV, principalmente in corrispondenza del Complesso I e Complesso III, generando così O2•¯ e/o H2O2 (riduzione uni- e

bivalente dell’ossigeno molecolare) (fig. 4.2) (Lenaz, 2001).

A livello mitocondriale, un’altra possibile fonte di ROS è rappresentata dalle monoammino-ossidasi (MAO, A e B) che, nel catalizzare la rimozione del gruppo amminico primario dalle ammine biogeniche, determinano la formazione di H2O2 (fig. 4.3) (Toninello e

altri, 2004).

Figura 4.3. Reazione catalizzata dalle MAOs. Eox/red = enzima ossidato/ridotto. Come i mitocondri, anche i perossisomi sono siti molto importanti di utilizzo dell’ossigeno. In questi organuli, il principale ROS prodotto è rappresentato dal H2O2. La sua formazione si deve alla presenza di

numerose ossidasi che utilizzano l’ossigeno molecolare per rimuovere atomi di idrogeno da substrati organici specifici in una reazione di tipo ossidativo che produce H2O2. Una delle più importanti funzione

ossidative fonte di ROS che hanno luogo nei perossisomi (particolarmente nelle cellule del fegato) è la degradazione di molecole di acidi grassi a lunga catena (β-ossidazione).

Come anticipato nel capitolo 2 (fig. 2.17), nel REL la produzione di ROS passa attraverso il sistema monoossigenasico citocromo P450- dipendente. Le principali specie coinvolte - O2•¯ e H2O2 - possono

formarsi come conseguenza del decadimento del complesso tra l’enzima e l’ossigen molecolare attivato, necessario per la funzione catalitica dell’enzima. Particolarmente coinvolte in questo processo sono le isoforme CYP2E1 e 2B, come conseguenza del metabolismo dell’etanolo e del fenobarbital, rispettivamente (Klaunig e Kamendulis, 2004).

Per quello che riguarda il citosol, numerosi sono i processi fonte di ROS. Fra questi, sono da menzionare il catabolismo dei nucleotidi purinici e la biogenesi delle poliammine.

A quest’ultimo processo partecipano le poliammido-ossidasi (PAOs), enzimi citosolici che catalizzano il taglio del legame -C-N- in gruppi amminici secondari con concomitante produzione di H2O2 (fig. 4.4)

(Toninello e altri, 2004).

Figura 4.4. Reazione catalizzata dalle PAOs.

Nel catabolismo dei nucleotidi purinici è invece coinvolta la xantina- ossidasi. Sebbene la xantina ossidasi presente nel normale tessuto sia un enzima deidrogenasi che trasferisce elettroni a NAD+ ossidando la xantina o l’ipoxantina a acido urico, sotto certe condizioni di stress la deidrogenasi è convertita in un enzima ossidasi mediante ossidazione di gruppi tiolici essenziali o mediante limitata proteolisi. In seguito a questa conversione l’enzima reagisce sempre come donatore di elettroni, ma riducendo l’ossigeno invece di NAD+, producendo così O2•¯ e H2O2 (fig. 4.5).

La produzione di ROS può subire un incremento notevole anche per effetto di stimolazioni esterne. Infatti, agenti fisici o chimici possono aumentarne direttamente o indirettamente la produzione.

Fra gli agenti fisici sono da menzionare le radiazioni ionizzanti e i raggi UV. Ambedue queste fonti energetiche possono indurre il fenomeno della scissione omolitica o fotolisi dell’acqua con conseguente produzione di specie radicaliche (Valko e altri, 2004). Fra gli agenti chimici, invece, l’ozono, i metalli, taluni farmaci e molti xenobiotici come gli idrocarburi aromatici policiclici, i composti clorinati, gli esteri del forbolo, ecc… sono in grado di indurre stress e conseguente danno ossidativo in vitro ed in vivo (Klaunig e Kamendulis, 2004) attraverso svariati meccanismi.