L’inizio dell’attività NADPH ossidasica coincide con la degranulazione, con un ritardo di circa 20 secondi (Segal et al., 1981). Le vie di trasmissione del segnale che connettono il legame a recettori di superficie all’innesco e al controllo della degranulazione sono complesse e non ancora definite con precisione.
L’esocitosi di granuli e vescicole secretorie si verifica grazie ad una serie di processi finemente controllati, comprendenti: la mobilitazione o traslocazione dei compartimenti granulari alla periferia della cellula, l’associazione dei granuli alla membrana plasmatica e l’aggancio tra granuli e membrana, prerequisito necessario per le successive fusione e liberazione dei mediatori. É interessante notare che i granuli sono rilasciati secondo un ordine inverso rispetto alla tempistica della loro sintesi: le vescicole secretorie sono i primi compartimenti ad essere mobilitati, seguiti, nell’ordine, dai granuli ricchi in gelatinasi, poi dai granuli specifici e infine, dai granuli azurofili (Faurschou et al., 2003). La stimolazione in vitro con concentrazioni dell’ordine del nanomolare di mediatori infiammatori quali l’fMLP causa la rapida e quasi totale degranulazione delle vescicole secretorie, lasciando praticamente intatti gli altri granuli (Sengelov et al., 1993). La stimolazione con agonisti puù potenti quali il forbol miristato acetato (PMA) provoca il rilascio completo dei granuli terziari, moderato dei granuli specifici e un’esocitosi scarsa da parte dei granuli azurofili.
La mobilizzazione gerarchica dei granuli dei neutrofili sopradescritta può essere riprodotta in vitro attraverso un incremento graduale delle concentrazioni intracellulari di calcio Ca2+ (Sengelov et al. 1993). La concentrazione citosolica di Ca2+ che induce la liberazione del 50% dei markers granulari (EC50) corriponde a: 140 nM per le vescicole secretorie, 250 nM per il granuli terziari, 550 nM per i granuli specifici e 680 nM per i granuli azurofili (la [Ca2+]i nei PMN a riposo é di 90-110 nM). Vari tipi di stimoli sono responsabili dell’aumento della concentrazione citosolica di Ca2+, tra cui la formazione di legame coinvolgenti L-selettine, CD11b/CD18 e recettori per l’fMLP. Il legame delle integrine β2 determina l’attivazione delle tirosin-chinasi citoplasmatiche, che fosforilano e attivano un ampio spettro di proteine, tra cui la fosfolipasi Cγ2 e la fosfolipasi D; queste ultime catalizzano la generazione di inositolo (1,4,5)-trifosfato (IP3), di diacilglicerolo e di acido fosfatidico. A loro volta, questi metaboliti attivano la protein chinasi C (PKC) provocando quindi il rilascio di Ca2+ dagli stores intracellulari e l’influsso di calcio attraverso la membrana plasmatica (Faurschou et al., 2003). Allo stesso modo, la stimolazione attraverso la via del recettore per l’fMLP accoppiato alla proteina G,
Introduzione
provoca un rapido aumento della concentrazione di IP3 a livelli sufficienti a mobilitare il Ca2+ dagli stores intracellulari.
Il meccanismo che lega il turnover lipidico e le modificazioni delle concentrazioni di Ca2+ alla degranulazione non é ancora noto con esattezza. Le annessine sono proteine in grado di legare fosfolipidi di membrana che, in presenza di elevate concentrazioni di calcio, intervengono nell’aggregazione delle vescicole e nella fusione alla membrana. Queste molecole hanno la capacità, polimerizzando, di formare un ponte e di mettere quindi in contatto due membrane di strutture secretorie. Vari tipi di annessine sono state identificate nei neutrofili che sembrano promuovere la fusione calcio-dipendente, in vitro; tra queste, l’annessina I, l’annessina XI e la lipocortina III.
Uno dei meccanismi di regolazione della mobilitazione dei granuli citoplasmatici è rappresentato dalla famiglia dei recettori SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor
attachment protein receptor) comprendente due classi di proteine: le SNARE vescicolari
(v-SNARE), di cui fanno parte i membri della famiglia VAMP (vesicle-associated membrane protein-2), e le SNARE target (t-SNARE) comprendenti le sintassine e i membri della famiglia SNAP-23/25. In particolare, nei neutrofili sono state identificate tra le v-SNARE, le VAMP-1, VAMP-2 e VAMP-7, e tra le t-SNARE, la SNAP23 ed un certo numero di sitassine, quali la sintassina 3, 4 e 6. La regolazione della secrezione dei differenti compartimenti citoplasmatici varia a seconda del tipo di granuli e coinvolge svariate associazioni di complessi SNARE: l’esocitosi dei granuli secondari e terziari impegna almeno 2 complessi SNARE composti da sintassina 4/SNAP-23/VAMP-1 o sintassina 4/SNAP-23/VAMP-2, mentre nella degranulazione dei granuli primari intervengono sintassina 4 e VAMP-1/7. Un ulteriore complesso contenente la sintassina 6 può intervenire nella regolazione dell’esocitosi dei granuli primari e secondari. Di conseguenza, la densità delle proteine SNARE nella membrana é connessa al potenziale di esocitosi dei differenti compartimenti granulari. L’importanza dei complessi SNARE nei processi di degranulazione é stata dimostrata da una serie di studi che hanno esaminato l’effetto inibitorio di neurotossine quali la neurotossina del tetano e del botulino: queste neurotossine colpiscono e scindono specificamente i complessi SNARE liberi, prevenendo quindi il loro assemblaggio nella fase di aggancio dei granuli alla membrana e impedendo, di conseguenza, la fusione dei granuli con la membrana (Schiavo et al., 2000; Turton et al., 2002).
Accanto alle proteine SNARE, l’efficacia del controllo del processo di fusione delle membrane richiede l’intervento di proteine della famiglia delle Munc-18; in particolare, le isoforme Munc 18-1, Munc 18-2 e Munc 18-3 sembrano essere coinvolte nella regolazione dell’esocitosi in svariati tessuti e tipi cellulari (Rizo et al., 2002). E’ stata recentemente mostrata l’esistenza nei
Introduzione
neutrofili umani delle isoforme Munc 18-2 e Munc 18-3 e la loro diversa implicazione nella regolazione della degranulazione: Munc 18-2 sarebbe implicata nell’esocitosi dei granuli primari e interagirebbe con la sintassina 3, mentre Munc 18-3 sarebbe coivolta più specificamente nel rilascio dei granuli secondari e terziari e interagirebbe con la sintassina 4 (Brochetta et al., 2008).
Un altro gruppo di proteine coinvolte nella trasduzione del segnale per l’avvio dei processi di esocitosi sembra essere la famiglia di proteine leganti il calcio EF-hand; appartengono a questa famiglia proteine ubiquitarie come la calmodulina e proteine con una distribuzione tessuto-specifica, quali la recoverina e NCS-1 (neuronal calcium sensor-1). NCS-1 é espressa essenzialmente nel tessuto nervoso dove modula il rilascio di neurotrasmettitori, agendo sulle strutture citoscheletriche. Nonostante il nome, NCS-1 é presente, oltre che a livello neuronale, anche nelle cellule cromaffini, nelle cellule epiteliali renali: a livello di questi tessuti, NCS-1 regolerebbe le funzioni secretorie e diversi aspetti del traffico vescicolare attraverso interazioni con altri componenti del processo di segnalazione transmembrana (Brochetta et al., 2003). Sembra inoltre che NCS-1 faccia parte del sistema SNARE e parteciperebbe quindi alla formazione dei complessi proteici che promuovono la fusione tra la membrana degli organuli secretori e la membrana target. NCS-1 é stata ritrovata anche nei neutrofili umani e nelle cellule della linea promielocitica HL-60, localizzata in particolare a livello dei granuli azurofili. (Brochetta et al., 2003).
É stato inoltre recentemente dimostrato il coinvolgimento di un membro della famiglia delle proteine Munc-13 nella regolazione dell’esocitosi (Pivot-Pajot et al. 2008). Le proteine Munc 13 rappresentano una famiglia di 4 proteine mammifere omologhe alla proteina Unc-13 di
Caenorhabditis elegans. Si tratta di proteine presenti a livello di svariate cellule secretorie (tra
cui le cellule neuronali, cromaffini, le cellule β pancreatiche e diverse cellule della linea ematopoietica), dove rivestono un ruolo chiave nella regolazione della via secretoria. Le proteine Munc-13 intervengono infatti nella formazione dei complessi SNARE e sembrano inoltre essere implicate nel priming dei granuli. In particolare, Munc-13-4, l’omologo di recente identificazione, risulta fortemente espresso nei neutrofili, con una localizzazione in parte citoplasmatica e in parte associata ai granuli specifici e terziari. Sembrerebbe che la ridistribuzione (calcio-dipendente) di Munc 13-4 alla membrana plasmatica in seguito alla stimolazione cellulare agisca come fattore “priming” per l’esocitosi (Pivot-Pajot et al., 2008). É stato recentemente proposto il coinvolgimento, nella regolazione della degranulazione, dell’efflusso di ioni cloruro (Cl-), che si verifica nei neutrofili durante la fagocitosi dei neutrofili (Busetto et al., 2007). Nei neutrofili a risposo (resting) infatti, la [Cl-]i è elevata: 80-100 mM
Introduzione
(Simchowitz et al., 1986); in risposta a stimoli solubili fisiologici e non, si assiste ad una rapida ed irreversibile diminuzione dei livelli di Cl- intracellulare, strettamente correlata a svariate funzioni dei neutrofili, quali l’attivazione e l’iperespressione di molecole di adesione, l’adesione cellulare e lo spreading, l’alcalinizzazione citoplasmatica e l’attivazione del burst respiratorio (Meyers et al., 1990; Menegazzi et al., 1996, 1999 e 2000; Perez-Cornejo et al., 2004). Utilizzando diversi tipi di inibitori noti del trasporto di ioni cloruro (quali l’acido etacrinico e l’acido niflumico), Busetto e colleghi hanno mostrato che l’inibizione dell’efflusso di Cl- è accompagnato dalla diminuzione:
• dell’uccisione di particelle opsonizzate di Candida albicans;
• della degranulazione degli stessi granuli azurofili (in particolare della MPO);
• della fusione dei granuli azurofili con la membrana fagosomale.
Gli stessi autori hanno anche mostrato come l’inibizione dell’efflusso di Cl- causasse una marcata diminuzione del rilascio di Ca2+ dagli stores intracellulari, in neutrofili stimolati con fMLP o blastospore opsonizzate di Candida albicans. Le vie di trasmissione del segnale coinvolte in questi fenomeni restano ancora da identificare, ma sembra evidente come le variazioni dei livelli di cloro intracellulare rivestano un ruolo importante nella modulazione di numerose funzione dei neutrofili.