La linea promielocitica PLB-985 é stata stabilita dal gruppo del prof. Rado nel 1987 (Tucker et al., 1987). Le cellule PLB-985 derivano da una linea di cellule umane, mieloidi, diploidi, ottenute a partire del sangue periferico di una paziente affetta da leucemia non linfoide acuta. Si tratta di cellule monomieloblastiche ad uno stadio di maturazione più precoce rispetto alla linea promielocitica HL-60 (anch’essa ampiamente utilizzata negli studi del complesso NADPH ossidasi). Le cellule PLB-985 possono essere differenziate in granulociti o in monociti/macrofagi in presenza di certi agenti induttori: PMA, dimetilsolfossido (DMSO), acido retinoico, dimetilformammide, cAMP. La Figura 8 (da Pivot-Pajot et al., 2010) mostra la
Introduzione
morfologia delle cellule PLB-985 ottenuta tramite microscopia a trasmissione elettronica prima (A) e dopo (B) induzione della differenziazione con DMSO.
Figura 8: Morfologia delle cellule PLB-985 in microscopia a trasmissione elettronica. A: Cellule PLB-985 promielocitarie non indotte; B: cellule PLB-985 dopo induzione della differenziazione con 0,5% dimetlformammide (DMF) (Da Pivot-Pajot et al., 2010).
In seguito al trattamento con l’agente chimico il nucleo delle cellule appare ridotto e polilobato, e nel citoplasma é possibile osservare la presenza di numerosi granuli. Alcune differenze nella morfologia di queste cellule rispetto a quella dei neutrofili sono comunque evidenzabili: le PLB-985 conservano infatti un nucleo più voluminoso e meno polilobato.
Le PLB-985 differenziate in granulociti o “neutrophils-like”, esprimono tutte le subunità del complesso NADPH ossdasi (gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox e p67phox), oltre che i granuli primari (Tucker et al., 1987), mentre le altre popolazioni granulari citoplasmatiche non sono state identificate.
Nel 1993 i ricercatori del gruppo di Dinauer hanno costituito una linea di PLB-985 in cui il gene
CYBB codificante per gp91phox o Nox2 é stato inattivato per ricombinazione omologa (Zhen et
al., 1993). Questa linea cellulare, detta X-CGD (o KO, knock out), é stata ottenuta inserendo, tramite ricombinazione omologa, una cassetta codificante per la fosfotransferasi igromicina B (HYG), a livello del terzo esone del gene CYBB (Fig. 9).
PLB-985 indifferenziate PLB-985 differenziate
0,5% DMF
Introduzione
Figura 9: Costruzione della linea cellulare PLB-985 X-CGD (KO). Interruzione del gene CYBB codificante per Nox2 tramite inserimento di una cassetta codificante per la fosfotransferasi igromicina B per ricombinazione omologa a livello del terzo esone del gene.
In questo modello cellulare, l’espressione di Nox2 risulta totalmente abolita e l’attività NADPH ossidasica conseguentemente assente. Questa linea permette di avere in coltura cellule “neutrophils-like” di tipo CGDX0. É inoltre possibile ripristinare un’attività ossidasi equivalente a quella delle cellule PLB-985 originali (wild-type, WT) grazie alla transfezione stabile del DNA complementare (cDNA) di Nox2 (cellule WT-Nox2) (Zhen et al., 1993).
Obiettivi della tesi
2. Obiettivi della tesi
L'uccisione di batteri e funghi da parte dei neutrofili è mediata dall’attività delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) prodotte in seguito all'attivazione della NADPH ossidasi, la cui tossicità è fortemente potenziata dalla mieloperossidasi (meccanismi ossidativi) e dall'azione di proteine microbicide contenute nei granuli citoplasmatici (meccanismi non ossidativi). Il coinvolgimento diretto delle specie reattive dell'ossigeno e della mieloperossidasi (MPO) nell’attività microbicida dei PMN è stato recentemente messo in discussione. Nuovi dati, infatti, sarebbero a favore dell'ipotesi secondo cui la NADPH ossidasi e le ROS giocherebbero un ruolo indiretto, funzionale all'attivazione dei meccanismi non ossidativi; ciò avverrebbe attraverso modificazioni chimico-fisiche dell’ambiente intrafagosomale (pH e tonicità) che favorirebbero la slatentizzazione e l'attivazione delle proteine antimicrobiche granulari (Reeves et al., 2002; Ahliwalia et al., 2004; Segal, 2005).
Recentemente, nel laboratorio del Prof Dri in cui ho condotto parte della tesi, è stato dimostrato che la tecnica comunemente impiegata per misurare l'attività microbicida dei PMN era inficiata da un grave errore metodologico che falsava i risultati ottenuti (Decleva et al., 2006). Adottando un metodo corretto che ovvia a tale inconveniente ci siamo proposti di riesaminare il ruolo relativo dei meccanismi ossidativi e non ossidativi nell’attività microbicida dei PMN nei confronti di vari tipi di microorganismi: batteri Gram negativi (Escherichia coli), batteri Gram positivi (Staphylococcus aureus) e funghi (Candida
albicans). In particolare abbiamo verificato il possibile coinvolgimento:
• dei flussi di ioni K+ ;
• delle modificazioni del pH fagosomale;
• del sistema mieloperossidasi-H2O2-cloruro.
L’utilizzo di linee cellulari differenziabili nel fenotipo granulocitico, quali le cellule PLB-985, si rivela particolarmente utile per lo studio dell’attività NADPH ossidasica e della produzione di ROS (Bouleven et al., 2006; Fay et al., 2006; Taylor et al., 2006; van Bruggen et al., 2004; Bionda et al., 2004; Li et al., 2005 e 2007). Recentemente, le ricerche svolte nel laboratorio della Dott.ssa Stasia nell’ambito del rapporto struttura-funzione delle proteina Nox2 nel modello cellulare PLB-985, hanno permesso di ottenere per la prima volta una linea di cellule PLB-985 mutanti caratterizzate da un’attività ossidasica superiore alle cellule controllo (Li et al., 2005). In questo contesto, ci siamo interessati a:
Obiettivi della tesi
• caratterizzare tale “super-produzione” di specie reattive dell’ossigeno da parte delle cellule mutanti in risposta ad agonisti particolati;
• determinare l’impatto della super-produzione di anioni superossido da parte delle cellule mutanti sull’attività microbicida di queste cellule nei confronti di differenti microorganismi;
• analizzare la composizione dei granuli citoplasmatici delle cellule PLB-985, seguendo la loro progressione lungo il fenotipo granulocitico, allo scopo, da un lato, di valutare l’importanza delle proteine antimicrobiche granulari (che costituiscono nel loro insieme, i meccanismi di killing ossigeno indipendenti) nell’attività microbicida di queste cellule e, dall’altro, di caratterizzare l’efficacia della differenziazione delle cellule PLB-985 in neutrophils-like.
Il disfunzionamento dei meccanismi microbicidi dei fagociti é alla base dell’elevata frequenza delle infezioni batteriche e fungine cui sono soggetti i pazienti affetti da malattia granulomatosa cronica (CGD). Parte di questo lavoro di tesi é stata dedicata alla caratterizzazione molecolare e funzionale di un raro caso di CGD X91-. Questi gli obiettivi che ci siamo prefissati:
• caratterizzare l’espressione e l’attività ossidasica dei granulociti del paziente;
• identificare la mutazione responsabile della malattia e determinarne le conseguenze sulla biogenesi della proteina;
• valutare l’effetto della mutazione identificata sull’attività microbicida dei neutrofili del paziente nei confronti di S. aureus, C. albicans ed E. coli.
Materiali e metodi