La tecnica della citometria a flusso permette di effettuare la numerazione e l’analisi multiparametrica di particelle (generalmente cellule) in sospensione in un mezzo liquido. L’analisi viene svolta individualmente per ogni cellula in funzione dei parametri studiati, quali la fluorescenza prodotta dagli anticorpi coniugati ad un agente fluoroforo o la fluorescenza emessa direttamente da composti fluorescenti. La fluorescenza emessa viene letta mediante un citofluorimetro FACScaliburTM (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Francia o Sparcks, MD) e misurata grazie a dei fotomoltiplicatori specifici per una gamma di lunghezze d’onda: canali FL1 (530 ± 15 nm), FL2 (585 ± 21 nm), FL3 (<650 nm) e FL4 (>661 nm). Le popolazioni cellulari vengono dapprima selezionate in base ai parametri fisici forward-scatter (FSC) e
side-scatter (SSC) indicativi, rispettivamente, delle dimensioni e della complessità delle particelle
analizzate: la creazione di un gate elettronico (R) che circoscrive la nuvola di eventi corrispondente alla popolazione campione consente di analizzare le emissioni di fluorescenza
Materiali e metodi
aggregati e detriti cellulari. Si analizzano quindi i tracciati fluorimetrici relativi alla regione selezionata, impiegando un amplificatore logaritmico. Per ogni campione si acquisiscono generalmente 10000 eventi (programma CellQuest, BD PharMingen) che vengono poi analizzati tramite il programma WinMDI 2.8.
3.D.1.1 Valutazione dell’espressione di Nox2
Materiali
Tampone di marcatura: PBS addizionato con 0.2% (p/v) di BSA e 1 mM CaCl2
mAb 7D5, anti-gp91phox mAb IgG1
Anticorpo secondario: anticorpo anti IgG di topo, coniugato con la ficoeritrina (PE)
5 × 105 cellule, risospese nel tampone di marcatura, vengono incubate 30 minuti in ghiaccio in presenza di 0.5 µg di anticorpo primario 7D5 diretto specificatamente contro un epitopo esterno di Nox2 (Yamauchi et al., 2001). Allo scopo di valutare le interazioni non specifiche dell’anticorpo, un’aliquota di cellule viene incubata nelle stesse condizioni con 0.5 µg di anticorpo murino IgG1 irrilevante (controllo isotipico). Dopo una rapida centrifugazione di 10 secondi a 10000 × g, le cellule sono sottoposte a due lavaggi successivi in tampone di marcatura. L’anticorpo primario 7D5 è rivelato grazie ad un anticorpo secondario anti-IgG di topo, coniugato con l’agente fluoroforo ficoeritrina che fluoresce nel canale del rosso (FL2): a questo scopo, le cellule sono incubate 30 minuti in ghiaccio e al buio in presenza di 0.5 µg di anticorpo secondario (Stasia et al., 2003). Al termine dell’incubazione, le cellule subiscono 2 ulteriori lavaggi nel tampone di marcatura e vengono poi risospese in 500 µL dello stesso tampone. Le sospensioni cellulari sono conservate in ghiaccio fino al momento della lettura al citofluorimetro.
3.D.1.2 Misura della produzione di perossido di idrogeno (test di ossidazione della DHR)
Materiali PBS
Bovine Serum Albumine, BSA, Sigma
Materiali e metodi
Azide, NaN3, Sigma
Forbol miristato acetato, PMA, Sigma
Difenileneiodonio, DPI, inibitore irreversibile della NADPH ossidasi, Sigma BM16, mAb anti CD294 (CRTH2)
La produzione di perossido di idrogeno è misurata tramite il test di ossidazione della diidrorodamina 123 (DHR 123). In questo saggio, il composto non fluorescente DHR viene covertito a rodamina, che fluoresce nel verde (canale FL1), dal perossido di idrogeno prodotto dalle cellule attivate da PMA. I neutrofili sono marcati con la DHR (c.f. 2 µM) per 30 minuti a temperatura ambiente e al buio prima di aggiungere l’azide (c.f. 1 mM). Le cellule sono quindi preriscaldate mediante incubazione di 10 min a 37°C e poi stimolate per aggiunta di PMA (c.f. 20 ng/mL) per 15 min. La reazione è bloccata mediante diluizione in PBS freddo e le provette sono conservate in ghiaccio; i campioni vengono infine analizzati al citofluorimetro per la fluorescenza verde (FL-1).
Negli esperimenti in cui, accanto all’attività ossidasica, le cellule venivano testate per valutare l’espressione del marker degli eosinofili, CRTH2, i campioni sono ulteriormente incubati in presenza di 2.5 µg/mL di mAb BM16 (anti CRTH2) per 30 minuti e sottoposti a due lavaggi successivi in PBS-BSA freddo, prima di essere analizzati al citofluorimetro.
3.D.1.3 Valutazione simultanea dell’espressione di Nox2 e dell’attività NADPH ossidasica
Materiali
Tampone di marcatura mAb 7D5, anti-gp91phox DHR
Anticorpo secondario: F(ab’)2 anti-IgG di topo coniugato al fluorocromo Alexa Fluor® 633 S. aureus 502A opsonizzati con 10% siero alla concentrazione di 2.5 × 108 batteri/mL in PBS-ioni
DPI
Le cellule coltivate PLB-985 o i neutrofili umani isolati sono diluiti alla concentrazione di 5 × 106 cellule/mL nel tampone di marcatura. Dapprima viene effettuata la marcatura di Nox2 tramite il mAb 7D5 secondo il protocollo precedentemente descritto, utilizzando l’anticorpo
Materiali e metodi
del rosso (FL4). Successivamente, allo scopo di valutare il metabolismo ossidativo, le stesse cellule vengono incubate per 30 minuti a 37°C al buio con la sonda DHR 123 (c.f. 0.5 µM), composto che diffonde liberamente nelle cellule localizzandosi, nei neutrofili, soprattutto a livello dei granuli. La specificità della produzione di derivati reattivi dell’ossigeno può essere verificata allestendo contemporaneamente alle altre, una prova in cui la sospensione di cellule è incubata in presenza di DPI (c.f. 5 µM), e che subirà i medesimi trattamenti delle altre prove. Dopo l’aggiunta dei microorganismi opsonizzati (rapporto cellula:batteri = 1:50), le sospensioni cellulari sono incubate per 15 minuti a 37°C. Al termine dell’incubazione, la reazione é bloccata diluendo i campioni in PBS freddo; le sospensioni sono quindi conservate in ghiaccio fino al momento della lettura al citofluorimetro. In seguito all’attivazione metabolica, gli intermedi reattivi dell’ossigeno prodotti, in particolare l’H2O2, ossidano la sonda DHR 123 trasformandola nel composto rodamina 123 (Rho 123) che fluoresce nel verde (FL1) se eccitato a 488 nm. I campioni vengono infine analizzati al citofluorimetro per la fluorescenza verde (FL1, 530 ± 30 nm) e per quella rossa (FL4, 648 ± 13 nm); l’utilizzo di questi due fluorocromi (la DHR 123 e l’Alexa Fluor® 633), caratterizzati da spettri di emissione separati permette di evitare la necessità di compensare i segnali di fluorescenza provenienti dalle due sonde.
Le cellule che esprimono la proteina gp91phox e metabolicamente attive risulteranno positive per entrambe le marcature (mAb 7D5 e DHR 123).
3.D.1.4 Valutazione dell’espressione di Nox2 in neutrofili ed eosinofili
Materiali
Tampone HEPES mAb 7D5, anti gp91phox Anticorpo irrilevante IgG1
Anticorpo secondario: F(ab’)2 anti-IgG di topo coniugato con la sonda Alexa Fluor® 488, Invitrogen
BM16, mAb anti CRTH2
I granulociti, diluiti a 107 cellule/mL in tampone HEPES, vengono incubati con 0.5 µg di anticorpo monoclonale 7D5 o con 0.5 µg di anticorpo irrilevante IgG1 per 30 minuti in ghiaccio, come descritto in precedenza. Al termine dell’incubazione, le cellule sono sottoposto a due lavaggi successivi in tampone HEPES, per essere poi nuovamente incubate per 30 minuti in
Materiali e metodi
ghiaccio in presenza di 0.25 µg dell’anticorpo secondario coniugato al fluorocromo Alexa Fluor® 488, che fluoresce nel canale del verde (FL1). Dopo 2 ulteriori lavaggi in tampone HEPES, le cellule vengono incubate con 2.5 µg/mL di anticorpo anti CRTH2 che fluoresce nel rosso (FL4). Dopo un ulteriore lavaggio in tampone HEPES, la fluorescenza emessa nei canali del verde (FL1) e del rosso (FL4) viene analizzata mediante un’acquisizione di 100000 eventi. (Anche in questo caso, l’utilizzo di questi due fluorocromi caratterizzati da due spettri di emissione non sovrapposti permette di evitare la necessità di effettuare una compensazione dei segnali).
Questo tipo di analisi citofluorimetrica a “doppia marcatura” permette di distinguere tra le cellule esprimenti la proteina gp91phox (e quindi positive solamente per la fluorescenza verde: 7D5 in FL1), la popolazione degli eosinofili, che risulta positiva anche per la fluorescenza rossa (BM16 in FL4).