CITOCHINE PROINFIAMMATORIE - Livelli circolanti di adipochine, FGF-21, Grelina, GIP, C-peptide

I precisi eventi fisiopatologici alla base della componente infiammatoria presente nell’obesità rimangono ancora non del tutto chiariti. Le richieste metaboliche degli adipociti ipertrofici superano l’apporto locale di ossigeno portando ad ipossia cellulare con attivazione di meccanismi cellulari di stress, _{con conseguente infiammazione}

cellulare rilascio di citochine e di segnali proinfiammatori102_{. Le chemochine secrete}

localmente richiamerebbero macrofagi nel tessuto adiposo dove essi formerebbero dei complessi intorno ai grossi adipociti morti o morenti e rilascerebbero quindi citochine in grado di estendere e amplificare il processo infiammatorio anche agli adipociti vicini, esacerbando la flogosi del tessuto stesso103,104.

La flogosi altera l’attività insulinica attraverso le vie di trasduzione del segnale del complesso chinasi/fattore nucleare kB (IKK-β/NF-kB) e la protein chinasi 1 c-Jun N- terminale (JNK1), che portano a fosforilazione del recettore insulinico (IRS-1) con inibizione della trasduzione del segnale. La disfunzione del recettore insulinico e l’incapacità di metabolizzare il glucosio nonostante normali livelli insulinici conducono verso una progressiva iperglicemia105.

L’infiammazione gioca un ruolo importante in tutti gli stadi dell’aterogenesi. Il processo inizia da un danno endoteliale dovuto a molteplici cause (ipertensione, fumo, dislipidemia, infezioni batteriche e/o virali) che determina una risposta infiammatoria. Leucociti, macrofagi e citochine proinfiammatorie sono coinvolti nella formazione di strie lipidiche, nella proliferazione dei miociti, nel rimodellamento della parete vascolare e quindi nella formazione della placca aterosclerotica106.

L’interleuchina 6 (IL-6) è rilasciata sia dal tessuto adiposo viscerale sia dai muscoli

scheletrici. Stimolando la sintesi di prostaglandine E2 (PGE2), rappresenta un

importante mediatore della febbre. Agisce a livello cerebrale, in particolare nell’ipotalamo, controllando l’appetito riducendo l’intake calorico e aumentando la spesa energetica107_{. IL-6 ha anche un ruolo anti-infiammatorio durante la contrazione}

muscolare inibendo citochine infiammatorie come il TNF-α e l’IL-1 e attivando citochine anti-infiammatorie come l’IL-10 e l’antagonista del recettore dell’IL-1108. IL-6 è iperespressa nel tessuto adiposo in condizioni di obesità e IR e tende a ridursi con la perdita di peso109,110. Inoltre le concentrazioni plasmatiche di IL-6 predicono lo sviluppo di T2DM e di patologie cardiovascolari111. IL-6 è il principale determinante della risposta infiammatoria di fase acuta stimolando la produzione epatica di proteina C reattiva (PCR), una pentraxina che si lega alla membrana plasmatica di cellule danneggiate causandone la morte attraverso l’attivazione della cascata del complemento112_{. La PCR è uno dei principali marker di rischio metabolico essendo}

collegata ad eventi cardiovascolari, all’aterosclerosi e alla progressione del T2DM113_. IL-

6 è un importante fattore di rischio cardiovascolare nelle donne in menopausa e numerosi studi mostrano un aumento dei suoi livelli circolanti in pazienti con MetS114 – 116_{. Esiste una stretta correlazione tra l’obesità centrale e i livelli sierici di IL-6 dovuti}

probabilmente ad un’aumentata produzione di questa citochina da parte degli adipociti e dei macrofagi nel tessuto adiposo, con effetti negativi sull’espressione genica, i TG, l’attività della lipoprotein lipasi e la sensibilità insulinica, contribuendo così allo sviluppo di MetS117_.

Il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) è una citochina proinfiammatoria prodotta da monociti e dai macrofagi anche a livello del grasso viscerale e ha un ruolo chiave nella flogosi e nelle patologie autoimmuni118_{. Diversi studi mostrano come il TNF-α}

determina IR inibendo sia il recettore insulinico sia il suo substrato IRS-1119_. Con azione

paracrina, il TNF-α determina un aumento dei livelli circolanti di FFA tramite lipolisi e lipogenesi epatica, inducendo dislipidemia e aterosclerosi120_{. Alcuni studi mostrano}

che i livelli di TNF-α sono positivamente associati con l’obesità e si riducono con la perdita di peso28,121, mentre altri studi non mostrano differenze di concentrazione della citochina tra gruppo di donne obese, magre, con e senza MetS in postmenopausa114–116. Queste discrepanze possono essere in parte spiegate dalla diversità dei criteri diagnostici di MetS usati nei vari studi. Ad ogni modo, sia IL-6 che TNF-α correlano positivamente con alcuni criteri della MetS, in particolare i livelli di IL- 6 correlano positivamente con la circonferenza addominale mentre i livelli di TNF-α sono associati positivamente con i livelli di pressione arteriosa.

La Galectina-3 (Gal-3) è una lectina che si lega alla β-galattosidasi. Si localizza sia a livello intra che extra-cellulare ed esplica numerose funzioni tra cui l’interazione cellulare, l’infiammazione, la differenziazione cellulare e l’apoptosi, giocando quindi un ruolo importante nell’adipogenesi e nell’aterosclerosi122_{. Gal-3 possiede sia attività}

localizzazione cellulare e delle condizioni fisiopatologiche. Gal-3 sembra avere un ruolo protettivo nell’iperglicemia: nei pazienti con T2DM troviamo elevati livelli di questa lectina che correlano positivamente con il BMI e negativamente con l’emoglobina glicata (HbA1c), nei ratti obesi e diabetici invece sembra proteggere le cellule β pancreatiche dagli effetti citotossici cell’IL-1β123,124_{. In uno studio su 2946 pazienti,}

invece, Gal-3 era associata con l’obesità addominale, la dislipidemia e l’ipertensione, ma non era predittivo di diabete e MetS dopo aggiustamento per fattori di rischio cardiometabolici125_{. In un recente studio in vivo, la somministrazione di Gal-3}

determinava IR e intolleranza glucidica, mentre la sua inibizione (farmacologica o genetica) migliorava la sensibilità insulinica nei soggetti obesi; in vitro, Gal-3 aumentava la chemiotassi dei macrofagi, riduceva l’uptake del glucosio nei miociti e negli adipociti e alterava la soppressione dell’output del glucosio mediato dall’insulina a livello epatocitario; inoltre, è stato riscontrato che Gal-3 lega direttamente il recettore insulinico inibendone la cascata del segnale intracellulare126_.

La Pentraxina-3 (PTX3) è una proteina di fase acuta prodotta da vari tipi di cellule (adipociti, monociti, neutrofili, macrofagi, cellule muscolari lisce, fibroblasti, cellule endoteliali) in risposta a stimoli proinfiammatori127. PTX3 presenta attività anti- infiammatoria, riducendo la produzione di citochine pro-infiammatorie, in particolare l’IL-β e il TNF-α128,129_{. Nonostante l’alta espressione di PTX3 mRNA nel tessuto adiposo,}

i livelli dii questa proteina sono ridotti nell’obesità129–131_{. Nei pazienti con MetS, i livelli}

di PTX3 appaiono alti e tendono ad aumentare con l’incremento della severità della sindrome132. Il ruolo della PTX-3 nella patogenesi dell’obesità, della MetS, del T2DM e dell’aterosclerosi restano ancora da chiarire.

L’Inibitore-1 dell’attivatore del plasminogeno (PAI-1) è il principale induttore della fibrinolisi vascolare e viene secreto dal fegato, dagli adipociti intra-addominali, dalle piastrine e dall’endotelio vascolare133. Inibisce l’attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) e l’attivatore urochinasi del plasminogeno (uPA) e viene considerato un marker di alterazione del sistema fibrinolitico e aterotrombosi134_{. I livelli plasmatici di PAI-1 sono}

aumentati nei soggetti obesi e negli stati infiammatori, aumentando così il rischio trombotico e cardiovascolare135–137_{. Vi è una forte correlazione con i parametri specifici}

della MetS, in particolare con l’aumento dei livelli ematici di TG e insulina, BMI e accumulo di grasso viscerale. Donne in post-menopausa con MetS presentano livelli elevati di PAI-1 e bassi livelli di uPA, con aumento del rischio tromboembolico e cardiovascolare114.

II- PRESUPPOSTI TEORICI

La transizione menopausale determina cambiamenti metabolici ed endocrini che alterano la composizione corporea e la distribuzione del grasso, con un rischio maggiore di sviluppare obesità addominale e, soprattutto, la sindrome metabolica (MetS). Il tessuto adiposo è un mix eterogeneo di diversi tipi cellulari (adipociti, cellule stromali, cellule immunitarie, cellule endoteliali) e svolge un ruolo importante nella regolazione di diverse funzioni endocrine e metaboliche: ossidazione lipidica, assunzione di cibo, immagazzinamento energetico, termogenesi, isolamento corporeo, secrezione di adipochine138–140_{. Le adipochine presentano funzioni endocrine,}

regolando l’infiammazione, il sistema immunitario e cardiovascolare e il metabolismo49,114,140–142_.

Molte donne in menopausa riferiscono un aumento dell'appetito, cambiamenti dell'umore e riduzione dell'attività fisica. Ciò può essere parzialmente spiegato da una disregolazione dei livelli e della funzionalità della leptina (ormone della sazietà) e della grelina (ormone della fame)54,143.

La MetS è una malattia cronica legata allo stile di vita e la sua prevalenza aumenta dopo la menopausa144. Questa sindrome è un insieme di fattori strettamente correlati ad anomalie metaboliche e lipidiche, obesità, resistenza all'insulina, disfunzione endoteliale, protrombosi, aterogenesi, infiammazione, stress ossidativo che aumentano il rischio cardiovascolare e oncologico145–148. L'invecchiamento femminile, l'obesità, la MetS e le sue morbosità sono un importante problema sanitario. Ci sono dati limitati su MetS in pre, peri e postmenopausa, adipochine, anomalie metaboliche e infiammatorie. In questo studio siamo andati a misurare funzione metabolica nelle donne pre, peri e postmenopausa, con e senza MetS e con e senza obesità viscerale.

III- SCOPO DELLA TESI

Lo scopo di questa tesi è stato quello di misurare marker relativi alle alterazioni metaboliche in donne in transizione menopausale (in pre, peri e postmenopausa) con e senza la Sindrome Metabolica e, inoltre, di valutarne le concentrazioni rispetto alla presenza o meno di obesità.

IV- MATERIALI E METODI

1 PARTECIPANTI E DISEGNO DI STUDIO

Da Settembre 2015 ad Agosto 2016 in collaborazione con l’Istituto Di Biomedicina Della Facoltà Di Medicina Dell’Universitad Catolica De Santiago De Guayaquil in Ecuador è stato condotto un programma di screening per la Sindrome metabolica. Hanno partecipato un totale di 202 donne in fisiologica pre, peri e post-menopausa (di età compresa fra i 40 e i 69 anni) reclutate attraverso un annuncio pubblicato su un quotidiano. Tutte le partecipanti non assumevano terapia ormonale sostitutiva (HT) al momento del reclutamento e coloro che assumevano fitoestrogeni o farmaci in grado di diminuire i livelli di lipidi furono escluse dallo studio. Il protocollo di ricerca dello studio è stato revisionato e approvato dal Comitato Scientifico Di Ricerca dell’istituto di Biomedicina. Ai soggetti consenzienti e corrispondenti ai criteri di inclusione è stato chiesto di recarsi all’Istituto per ricevere le dovute informazioni riguardo allo studio e per firmare il consenso informato. Dopo 8 ore di digiuno notturno, nelle donne arruolate, sono stati raccolti i seguenti dati: informazioni socio-demografiche, circonferenza vita, peso (BMI), altezza, misurazione della pressione arteriosa. Inoltre, è stato prelevato un campione di circa 10-15ml di sangue venoso periferico. Per gli scopi del presente studio, il siero delle 80 partecipanti appartenenti alla coorte iniziale è stato analizzato per valutare la concentrazione di diversi analiti:

• Adipochine: Adiponectina, Adipsina, Leptina, Resistina, Visfatina, Vaspina, Omentin-1

• Metabolismo: C-peptide, Grelina, Glucagon-like Peptide 1 (GLP-1), Peptide Inibitorio Gastrico (GIP), Insulina, Fattore di Crescita dei Fibroblasti 21 e 23 (FGF-21, FGF-23), Recettore Solubile della Leptina (sLeptinR), Paraoxonasi-1

(PON-1)

• Infiammazione: Galectin-3, Pentraxin-3, Inibitore-1 dell’Attivatore del Plasminogeno (PAI-1), Fattore di Necrosi Tumorale-α (TNF-α), interleuchina-6 (IL-6), interleuchina-8 (IL-8), Angiopoietina-2, Endoglina, Ligando Solubile CD40 (sCD40L), Ligando Solubile Fas (sFAsL), Proteina Liigante il Fattore di Crescita Insulino Simile-1 (IGFBP-1), l’Attivatore dell’u-Plasminogeno (u-PA), Fattore di Crescita Endotelio Vascolare-A (VEGF-A) [risultati non presenti in questa tesi]. È stata quindi confrontata la concentrazione delle varie molecole in pre, peri e postmenopausa, con e senza MetS, con o senza obesità (BMI>30 kg/m2).

2 DIAGNOSI DI SINDROME METABOLICA

La diagnosi di MetS è stata posta utilizzando i criteri diagnostici di Adult Treatment Panel III, modificati dall’American Heart Association e dal National Heart, Lung and Blood Institute149_{. Per l’inclusione era, quindi, necessario soddisfare tre o più dei}

seguenti criteri:

• Obesità addominale (circonferenza vita >88 cm, misurata in posizione supina) • Elevati livelli di trigliceridi (>150 mg/dL)

• Bassi livelli di colesterolo legato a lipoproteine a alta densità (HDL-C) (<50 mg/dL)

• Iperglicemia (>100 mg/dL o utilizzo di famaci ipoglicemizzanti) • Ipertensione (130/85 mmHg, o utilizzo di antiipertensivi)

3 ANALISI DEL SIERO E MISURAZIONE DEGLI ANALITI

I campioni ematici di tuti i partecipanti sono stati centrifugati a 5°C per 10 minuti a 3000 rpm. Il siero ottenuto è stato trattato secondo il manuale d’istruzione, decantato in aliquote di 0,5 ml e poi stoccato a -70°C. Successivamente, e prima di procedere con l’analisi, sono stati aggiunti ai campioni l’inibitore DDP-IV e l’aprotinina (Sigma Aldrich, St.Louis, MO, USA) alla concentrazione finale di 100 μM e 0,013%, rispettivamente. La concentrazione dei trigliceridi (TG), del colesterolo HDL e del glucosio sono state valutate utilizzando un metodo enzimatico colorimetrico con l’analizzatore automatico fotometrico Hitachi 717 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). La concentrazione dei vari analiti studiati è stata valutata utilizzando il Bio-Plex 200 System® (Bio-Rad Laboratories, Inc, CA, USA) presso Bioclarma srl, Torino, Italia150.

4 CARATTERISTICHE DEL SAGGIO: BIO-PLEX SYSTEM

Bio-Plex® multiplex assay è un saggio immunoenzimatico costituito da sfere che hanno sia proprietà magnetiche sia fluorescenti (Beads) utilizzando un’unica piastra di 96 pozzetti. Il principio del saggio è simile a quello del sandwich ELISA. Anticorpi specifici, diretti contro i biomarker desiderati, sono covalentemente accoppiati ai beads. Questo complesso reagisce con il campione contenente il biomarker di interesse. Dopo una serie di lavaggi, necessari per rimuovere le proteine non legate, viene aggiunto un anticorpo biotinilato al fine di creare un complesso sandwich. La detezione finale del complesso avviene grazie all’aggiunta di un coniugato di streptavidina-picoeritina (SA- PE). La picoeritina serve come indicatore di fluorescenza. L’utilizzo di differenti beads permette la simultanea identificazione e quantificazione di molteplici analiti (circa 100)

presenti nello stesso campione (2μl di campione di siero)151 (Figura 8). L’acquisizione dei dati e l’analisi della reazione viene effettuata utilizzando un sistema Bio-Plex o un similare lettore Luminex- based. Quando la sospensione di un multiplo saggio viene inserita nel lettore Bio-plex 200, un laser rosso (635 nm) illumina la fluorescenza di ogni bead provvedendo a una classificazione degli stessi e quindi alla lettura del saggio. Allo stesso tempo, un laser verde (532 nm) eccita la picoeritina generando il segnale di lettura che è detettato da un tubo fotomoltiplicatore (PMT). Un processore digitale a alta velocità gestisce l’output dei dati e Bio-Plex ManagerTM software rappresenta i dati sia come Intensità di fluorescenza mediana (MFI) sia come concentrazione (pg/ml). La concentrazione degli analiti legati a ciascun bead è proporzionale al MFI del segnale inviato152_.

Nel documento Livelli circolanti di adipochine, FGF-21, Grelina, GIP, C-peptide e Insulina in donne in pre, peri e postmenopausa con e senza la Sindrome Metabolica (pagine 42-55)