CNVs ed Autismo

Numerosi studi genome-wide, condotti al fine di testare l’associazione dei CNVs con malattie neuropsichiatriche, hanno rivelato che tali disordini sono per lo più causati da CNVs rari e altamente penetranti, che coinvolgono la perdita, l’acquisto o la distruzione di geni sensibili al dosaggio [Cook & Scherer, 2008]. Nello studio condotto dall’AGP e pubblicato nel 2007, analizzando circa 1500 famiglie multiplex con autismo idiopatico mediante l’Affimetrix Gene Chip 10K (10.000 SNPs), è stato identificato un numero inaspettatamente elevato di varianti strutturali submicroscopiche. In particolare sono state identificate 254 CNVs, di lunghezza media di 3.4 Mb, in 196 probandi provenienti da 173 famiglie e 10 CNVs de novo, tra

48 queste ultime, una delezione de novo sul cromosoma 2q16 presente in due fratelli affetti, che coinvolge il gene della neurexina1 [AGP, 2007] (Fig 2.11).

Figura 2.11: CNVs identificate nello studio pubblicato nel 2007 dall’AGP. Nel rettangolino è

evidenziata la delezione de novo nel gene NRX1.

La neurexina è un buon candidato per l’ASD poiché svolge un ruolo importante nella sinaptogenesi e mutazioni rare in questo gene sembrano generare un aumento di rischio per lo sviluppo delle patologie dello spettro autistico [AGP, 2007].

Sempre nel 2007, è stato portato a termine un altro screening di CNVs mediante CGH array in 118 famiglie sigleton, 47 famiglie multiplex e 99 controlli. Nelle famiglie con ASD è stato identificato un maggior numero di CNV de novo rispetto ai controlli, differenza che diventa ancora più spiccata nelle famiglie singleton rispetto alle multiplex (la percentuale di CNVs identificati è di circa 2-3% nelle multiplex, 7-10% nelle singleton, 1% nei controlli). Ciò suggerisce che vi possano essere meccanismi diversi alla base dei casi sporadici e familiari [Sebat et al.,2007].

In molti casi individui non imparentati possiedono CNV, de novo o ereditati, allo stesso locus ed alcuni di questi coincidono con disordini genomici noti, mentre altri coinvolgono geni associati al ritardo mentale. Inoltre i CNVs che sembrano avere un ruolo nell’eziologia dell’autismo colpiscono soprattutto i geni dei complessi sinaptici neuronali, quali SHANK3, NLGN4 e NRXN1 [Cook & Scherer, 2008].

49 Un’ulteriore evidenza di associazione tra CNVs e autismo proviene da uno studio sull’intero genoma condotto nel 2008 mediante la piattaforma di microarray Affymetrix 5.0, allo scopo di trovare varianti genetiche associate all’autismo [Weiss et al., 2008]. È stato tipizzato un campione di 751 famiglie multiplex con individui affetti da autismo ma senza anormalità cromosomiche provenienti dall’Autism Genetic Resource Exchange (AGRE)[Geschwind et al., 2001]. Il risultato più significativo è stata l’identificazione di una regione nel cromosoma 16p11.2 che appare deleta o duplicata nell’1% delle famiglie multiplex analizzate. La regione contiene circa 25 geni tutti buoni candidati per l’autismo in quanto ampiamente espressi nel cervello e coinvolti nello sviluppo neuronale [Weiss et al, 2008]. Successivi studi condotti sulla regione 16p11.2 hanno evidenziato che le varianti strutturali identificate sembrano non essere specifiche per l’autismo, ma sono presenti anche in casi di dimorfismo facciale e di ritardo mentale [Cook and Scherer, 2008]. Questi studi suggeriscono che perdite o acquisizioni di materiale al medesimo locus possano influenzare più di un carattere (effetto pleiotropico), accrescendo il rischio per una vasta gamma di patologie neuropsichiatriche. Ciò significa che questi loci hanno bassa penetranza ed espressività variabile, con fenotipi che variano da anomalie di media gravità fino al Ritardo Mentale (MR), all’autismo e alla schizofrenia [Stefansson et al., 2008; Cook e Scherer, 2008]. Un altro esempio è dato dalle microdelezioni nella regione cromosomica in 15q13.3, che presentano un’estesa variabilità fenotipica, essendo presenti in individui normali, in casi di epilessia, di MR, di autismo o schizofrenia [Helbig et al, 2009, Sharp et al, 2008, Pagnamenta et al, 2008, Miller et al, 2008; Stefansson et al, 2008]

Dall’analisi dei dati di SNP array utilizzati per il GWAS pubblicato dal gruppo di Wang (Wang et al. ,2009), sono emerse risultati significativi per delezioni o duplicazioni che sono individualmente molto rare, ma che tendono a coinvolgere geni implicati nell’adesione cellulare o appartenenti alla via dell’ubiquitina, meccanismo anch’esso coinvolto nella regolazione della connettività neuronale [Glessner et al., 2009].

Per far luce sul contributo di varianti rare nei disturbi dello spettro autistico, nel 2010 l’AGP ha realizzato uno studio su larga scala, tipizzando 1275 casi ASDs e 1981 controlli con lo SNP array Illumina Infinium 1M [AGP, 2010]. Considerando solo gli individui di origine europea, almeno il 5,7% degli affetti risulta portatore di un CNV de novo e, a differenza di quanto osservato nei lavori precedenti, il tasso di CNVs de

50 novo risulta molto simile per famiglie simplex e multiplex (5,6% e 5,5%). Inoltre, allo scopo di valutare se geni e CNVs precedentemente associati ad ASD o a ritardo mentale fossero maggiormente presenti nei casi rispetto ai controlli, sono stati definiti tre gruppi di geni: geni implicati nell’ASD (ASD implicated), geni del ritardo mentale (Intellectual disability) e geni candidati ASD (ASD candidates) . I risultati mostrati in figura 2.12 indicano che CNV rari (con frequenza minore dell’1%) che colpiscono i geni implicati in ASD e quelli del ritardo mentale sono maggiormente presenti nei casi rispetto ai controlli, sia quando questi due set di geni sono considerati singolarmente che in combinazione. Al contrario se si confronta la percentuale di CNV che interessano i geni candidati ASD la differenza tra casi e controlli risulta non significativa.

Figura 2.12:CNV identificati in geni noti ASD o implicati nel ritardo mentale

Infine, al fine di identificare set di geni colpiti da CNV che condividono una funzione comune o che operano nella stessa via del segnale (pathway), è stata costruita una mappa funzionale di geni coinvolti nei disturbi ASD: la maggior parte dei CNV identificati distruggono geni coinvolti nell’adesione cellulare, nella glicosilazione, nell’organizzazione del citoscheletro, nella via di segnalazione Ras/GTPasi e, soprattutto, nello sviluppo del sistema nervoso. (Fig.2.13)

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Figura 2.13: Mappa funzionale che mostra le connessioni tra le categorie geniche (gene-sets)

maggiormente colpite da rari CNVs nei casi ASDs rispetto ai controlli. Ogni categoria è rappresentata da un nodo, le cui dimensioni sono direttamente proporzionali al numero di geni che ne fanno parte. I gruppi funzionali principali sono indicati dalle aree verdi (colpiti da delezioni) e blu (noti per essere in ASDs o in Intellectual Disability, ID).

Questi dati supportano quindi il coinvolgimento dei CNVs rari, sia sparsi in tutto il genoma che in specifici loci, nella suscettibilità all’ASD e sottolineano il ruolo di molecole, quali SHANK3, NRXN1 e NLGN3, nella maturazione e funzionalità delle sinapsi glutammatergiche [Pinto et al., 2010].

Recentemente, usando differenti piattaforme di microarray sulla stessa coorte di pazienti, due studi indipendenti condotti da Sanders [Sanders et al., 2011] e Levy [Levy et al., 2011] hanno confermato il ruolo dei CNV de novo nell’eziologia dell’autismo idiopatico. L’analisi di un gran numero di famiglie singleton provenienti dalla collezione Simons Simplex (Simons Simplex Collection, SSC), ha permesso loro di confermare multipli loci ASD noti ma anche di identificarne dei nuovi. In particolare i risultati ottenuti dallo studio di Levy rilevano che un grande contributo alla suscettibilità dei disturbi dello spettro autistico è svolto da CNV “ultra rari”, soprattutto duplicazioni ereditarie, presenti nei probandi, ma non nei loro fratelli non affetti. E’ stata anche ipotizzata una maggiore resistenza al fenotipo autistico da parte di probandi di sesso femminile rispetto a quelli di sesso maschile: le femmine con ASD hanno una più alta frequenza di eventi de novo (11,7%) rispetto ai maschi (7,4%) ed, inoltre i CNV de novo colpiscono un maggior numero di geni. Sanders e collaboratori, invece, non hanno identificato un ruolo causale di CNV rari legati al

52 cromosoma X, dal momento che non hanno rilevato differenze significative tra probandi maschi e probandi di sesso femminile per quanto riguarda il tipo di CNV e il suo effetto fenotipico. Tuttavia, l’identificazione di un grande network biologico di geni colpiti da CNV rari de novo mostra in maniera convincente che sono richiesti più forti sconvolgimenti funzionali per scatenare il fenotipo autistico nelle femmine rispetto ai maschi. Inoltre, poichè tale network racchiude geni implicati in precedenza nel fenotipo autistico e principalmente coinvolti nello sviluppo sinaptico, targeting assonico e motilità neuronale, questo potrebbe dimostrare che l’analisi funzionale di varianti genetiche rare può essere un approccio valido per l’identificazione di pathway biologici alla base di fenotipi umani complessi [Gilman et al., 2011](Fig 2.14)

Figura 2.14: Geni associati con la morfogenesi delle spine dendritiche. Le proteine mostrate in figura

giocano un ruolo cruciale nella formazione dei contatti fisici tra gli assoni e i dendriti, nell‟organizzazione della densità post-sinaptica (PSD) e nei processi di segnalazione che controllano la morfologia delle spine dendritiche. Molti dei pathway convergono sulla regolazione della crescita e della ramificazione dei filamenti di actina, essenziali nel rimodellamento strutturale delle spine. Le proteine codificate da geni colpiti da CNV de novo associati al fenotipo autistico sono colorate in giallo, mentre altri geni colpiti da CNV de novo identificati nello studio condotto da Levy sono indicati in blu; i geni già implicati nell‟autismo sono cerchiati invece in rosso.( Sarah R. Gilman, et al ,2011)