6. RISULTATI:
6.6. Screening di mutazione del gene CNTNAP5
Il gene CNTNAP5 risulta essere un ottimo gene candidato per l’autismo per diverse ragioni. Innanzitutto, delezioni in CNTNAP5 non sono descritte in DGV né sono state trovate nel campione di 2091 controlli analizzati mediante SNP Array 550K. Inoltre, questa delezione è trasmessa dal padre, che i clinici hanno riportato mostrare vari tratti autistici, anche se non ha una diagnosi formale di autismo, e nei due figli affetti da autismo, ma non nella sorella dislessica. Per di più, dall’anamnesi familiare è emerso che, anche altri familiari da parte del padre sembrano avere problemi neuropsichiatrici (figura xxx). Infine, il gene CNTNAP5 codifica per una proteina transmembrana appartenente alla famiglia delle Neurexine, che media il contatto cellulare e le interazioni nel sistema nervoso, giocando un ruolo fondamentale nel suo sviluppo e nel suo funzionamento.
Figura 6.26: famiglia estesa del padre 15-0084-001. In grigio sono indicati gli individui della famiglia che
mostrano sintomi autistici, in verde individui affetti da autismo e dislessia, in nero individui con ASD, in giallo quelli con la dislessia e nel simbolo a righe è indicata una sorella del padre con autismo e sindrome di Down. A fine di verificare se il gene CNTNAP5 potesse svolgere un ruolo nella suscettibilità all’ASD, abbiamo sequenziato tutti i 24 esoni di CNTNAP5 in 143 individui affetti appertenenti alla collezione di famiglie multiplex dell’IMGSAC, che condividono 1 o 2 alleli identici per discendenza nella regione 2q14.3 dove è localizzato il gene CNTNAP5.
La sequenza ottenuta è stata analizzata comparandola con la sequenza di riferimento dell’mRNA di CNTNAP5 (NM_130773).
Lo screening di mutazione ha portato all’identificazione di 3 mutazioni non sinonime in individui con ASD e non descritte in dbSNP (build 130).
123 Nell’esone 14, abbiamo evidenziato una transversione C G che provoca un cambio amminoacidico Prolina Arginina, in posizione 714 (P714R) che ricade nel dominio fibrinogeno C-terminale. Il residuo di prolina è poco conservato durante l’evoluzione ma la sua perdita comporta alterazione nella struttura della proteina. Questa variante è trasmessa dalla madre ad entrambi i figli affetti ma non alla figlia sana (Fig. A)
Figura A: Segregazione della mutazione nell’esone 14 di CNTNAP5 nella famiglia 14-5221. Lo SNP è indicato
dalla freccia.
Per verificare se questa variante fosse presente anche in un campione di controllo, abbiamo analizzato 466 individui controllo, mediante PCR seguita da digestione con l’enzima di restrizione Mnl1. Mnl1 riconosce la sequenza CCTC e in assenza della variante G taglia il prodotto di PCR in un solo punto portando alla formazione di due frammenti (di 156 bp e di 206bp), invece la presenza della variante G porta alla formazione di un ulteriore sito di riconoscimento per l’enzima Mnl1, per cui, dopo la digestione si avranno 3 frammenti (151 bp, 205 bp e 211bp). La variante è stata trovata in un solo individuo.(Fig 6.27)
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Figura 6.27: Gel di agarosio della digestione dei controlli con l’enzima Mnl1. E’ stato evidenziato l’individuo
con lo SNPs (+) e il controllo risultato positivo (Contr. +) la banda in alto indica il frammento di PCR non digerito è di 374bp.
Nell’esone 18, abbiamo trovato una transizione C T che provoca un cambio amminoacidico Treonina Metionina (T919M). Questa mutazione è trasmessa dalla madre ad entrambi i figli affetti ma non alle 2 figlie sane. (fig B)
Figura B: Segregazione della mutazione nell’esone 18 di CNTNAP5 nella famiglia 12-0188. Lo SNP è indicato
dalla freccia.
Secondo le predizioni bioinformatiche, la mancanza della Treonina provoca un danno alla struttura della proteina.
125 Anche in questo caso abbiamo analizzato 611 controlli per la presenza della variate allelica T mediante PCR seguita da digestione con l’enzima di restrizione HpyCH4IV senza mai trovarla.
Nell’esone 22, abbiamo trovato una transizione G A che provoca un cambio amminoacidico Valina Isoleucina (V1168I), all’interno del dominio 4 simile alla laminina G. Questa mutazione è trasmessa dalla madre ad entrambi i figli affetti ma non al fratello sano. (Fig C)
Figura C: Segregazione della mutazione nell’esone 22 di CNTNAP5 nella famiglia 12-0269. Lo SNP è indicato
dalla freccia.
Sempre mediante digestione con l’enzima di restrizione HpyCH4IV sono stati analizzati 1232 controlli e l’alterazione non è mai stata trovata.
Sebbene entrambi gli amminoacidi siano alifatici, e secondo gli strumenti di predizione bioinformatici questa mutazione non sia dannosa, la Valina nella posizione 1168 è molto conservata tra le specie.
Le due varianti, che non sono state trovate negli individui di controllo (T919M e V1168I), sono state analizzate in altri 380 individui tedeschi con ASD. Mentre non è stato trovato nessun altro individuo con la variante T919M, la mutazione V1168I è stata trovata in un altro caso tedesco con ASD. Tuttavia, in questa seconda famiglia, la mutazione non è trasmessa anche all’altro fratello affetto. Dunque, in totale questa mutazione è stata trovata in 2/523
126 individui con ASD e in 0/616 individui di controllo. Tale differenza non riuslta essere statisticamente significativa (test esatto di Fisher, p-value=0.211).
Tramite digestione con l’enzima di restrizione del prodotto di PCR dell’esone 22, abbiamo anche identificato un polimorfismo C/T che porta ad un cambiamento da Treonina a Metionina (T1195M). In totale, questo polimorfismo (rs34165507) è presente con una frequenza dell’allele minore del 3.1% nei casi con ASD (32 su 1046 cromosomi) in confronto a quella del 2.9% negli individui di controllo (36 su 1232 cromosomi). Tale differenza non risulta essere statisticamente significativa (test chi-quadrato, p-value=0.848).
Infine, lo screening di sequenza del gene CNTNAP5 è stato effettuato anche in uno dei probandi della famiglia 15-0084, per determinare se oltre alla delezione di CNTNAP5, ereditata dal padre, fossero presenti altre varianti patologiche, ereditate dalla madre. Tuttavia, sono stati trovati solo un cambiamento C/T in una regione non conservata del 5’UTR ed un altro polimorfismo intronico comune (rs924802), nessuno dei quali può probabilmente colpire la funzione o l’espressione del gene.
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