Screening di mutazioni nel gene CADPS2 in individui affetti da

Dai risultati dell’analisi di pazienti con ritardo mentale mediante array CGH è emersa una delezione presente in eterozigosi in due individui affetti da MR ed autismo, appartenenti ad una stessa famiglia (fratello e sorella) (fig 7.1). Questa delezione è lunga circa 250 kb ed è localizzata sul cromosoma 7q, in corrispondenza del locus AUTS1. Dato che questa delezione è presente in entrambi i figli affetti, mentre è assente nel padre, è probabile che essa sia stata ereditata dalla madre che aveva problemi cognitivi, ma di cui non abbiamo il DNA in quanto è deceduta in seguito ad un tumore (fig.7.2).

Figura 7.1: risultati array CGH. Tutti i pazienti sono stati analizzati mediante la metodica a loop (vedi

materiali e metodi). A) identificazione della delezione che coinvolge il gene CADPS2 in un paziente affetto da ritardo mentale e autismo B) Quando si analizza il paziente contro la sorella, entrambi affetti da ritardo mentale, la delezione non si osserva più, indicando che anche la sorella ha la stessa alterazione strutturale. C) quando il paziente è analizzato contro il padre si può notare la presenza della delezione nel paziente, indicando che il padre non è deleto in quella regione.

135 Questa delezione coinvolge il gene CADPS2, che rappresenta un buon candidato funzionale per l’autismo poiché è coinvolto nel rilascio di alcune neurotrofine (NT3 e BDNF) e codifica per una proteina che è localizzata nelle vescicole, a livello delle giunzioni presinaptiche.

Dai risultati di aCGH, la massima regione deleta va dall’esone 3 compreso fino alla fine del gene (esone 30), mentre la minima regione deleta, ossia quella sicuramente deleta, va dall’esone 7 all’esone 27 di CADPS2 (fig.7.3)

Figura 7.3: confini della delezione che coinvolge il gene CADPS2: nel rettangolo rosso è indicata la

regione sicuramente deleta che comprende le sonde: da A_14_P109803 (chr7:121788199-121788258) a A_14_P137087 (chr7:122030022-122030081), nel rettangolo in blu sono indicate le regioni incerte, quelle sicuramente non delete sono la sonda A_14_P114941 (chr7:121747156-121747215) e la sonda A_14_P104440 (chr7:122126405-122126464),

Tramite Real time PCR, abbiamo determinato i confini esatti della delezione: al 5' il punto di rottura è tra l'esone 3 (NON deleto in real time) e l'esone 4 (deleto in real time). Al 3' invece il punto di rottura è tra l'esone 26 (deleto in real time) e l'esone 29 (NON deleto in real time) (Fig.7.4).

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Figura 7.4: Numero di copie dei frammenti del gene CADPS2 analizzati per Real Time PCR nella

famiglia con due figli affetti da ritardo mentale ed autismo, appartenenti al consorzio CHERISH. I frammenti amplificati con i primers specifici per l’esone 4, 6, 7, 26, e per l’esone 28 di CADPS2 mostrano un relative copy number intorno allo 0.4-0.6 nei due figli affetti (sorella e fratello) , indice della presenza della delezione su uno dei due alleli del gene, mentre nel padre tutte le sonde utilizzate hanno un relative copy number intorno all’1, indicando che il padre ha due copie dell’allele e confermando i risultati dell’array CGH

Per verificare se CADPS2 potesse avere un ruolo nella suscettibilità all’autismo e/o al ritardo mentale, abbiamo sequenziato l’intera regione codificante del gene (30 esoni) in 96 individui italiani affetti da autismo e 36 individui italiani affetti da MR.

Da questo screening di sequenza del gene CADPS2, abbiamo identificato due varianti esoniche comuni già descritte in dbSNP (rs2251761 nell’esone 3 e rs2074589 nell’esone 17,) e 6 varianti esoniche rare che sono state identificate in 6 individui differenti (tabella 7.5) POSIZIONE NEL GENE ALLELE MAGGIORE / MINORE TIPO VARIANTE POLYPHEN SCORE ORIGINE MAF NEI CASI DI ASD MAF NEI CASI DI MR MAF NEI CONTROLLI Esone 1 Silent (A26A) --- MATERNA I/188 0/74 NA Esone 3 A/G Silen t(L252L)

rs2251761 - - 37/174 12/74 2/113**

Esone 6 C/G Silent(A402A) --- PATERNA I/188 0/74 0/500 Esone 13 G/A M630T 2.662 PATERNA I/188 0/74 I/516 Esone 13 C/G F645V 1.248 MATERNA I/188 0/74 0/500 Esone 17 A/C Silent (T819T)

rs2074589 48/188 6/74 9/113**

Esone 25 G/A D1113N MATERNA I/188 0/74 0/500

Esone 26 G/A V1137M 1.162 MATERNA 0/188 I/74 0/500

Tabella 7.5: Varianti identificate nello screening del gene CADPS2 in 94 pazienti affetti da autismo e

37 pazienti affetti da ritardo mentale. ** frequenza descritta in HapMap nella popolazione CEU.

Le varianti rare più interessanti identificate nel gene CADPS2 sono:

 Nell’esone 13, due mutazioni missenso, la prima è una transizione T  C che provoca un cambio amminoacidico Metionina Treonina, in posizione 630 (M630T) della sequenza amminoacidica della proteina (fig.7.5); questa mutazione è trasmessa dal padre ed è stata trovata in un solo controllo (1/258 individui di controllo analizzati tramite analisi di sequenza).

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Figura 7.5: Cromatogramma della sequenza dell’esone 13 di CADPS2 nella famiglia

SM_128. Il padre (SM_128.1) trasmette la mutazione missenso (T  C) al figlio (SM_128.3).

 La seconda mutazione trovata nell’esone 13 di CADPS2 è una transizione T  G che provoca un cambio amminoacidico Fenilalanina  Valina, in posizione 645 (F645V).

Figura 7.6: cromatogramma della sequenza dell’esone 13 di CADPS2 nella famiglia

SM_118. La madre (SM_118.2) trasmette la mutazione (T  G) al figlio (SM_118.3).

Questa mutazione F645V, ereditata dalla madre, non è stata trovata in circa 250 individui controllo.

 Nell’esone 25, una mutazione GA, ereditata dalla madre, che porta ad un cambiamento D1113N nella sequenza amminoacidica della proteina. Questa variante, non è stata trovata in nessuno dei 250 individui di controllo analizzati.

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Figura 7.7: cromatogramma della sequenza dell’esone 25 di CADPS2 nel quale si vede la

variante A presente in eterozigosi nell’individuo SM_24.3 e nella madre SM_24.2.

 Nell’esone 26, una mutazione GA in un paziente affetto da ritardo mentale. Questa mutazione porta ad un cambiamento V1137M nella proteina ed è ereditato dalla madre; da notare che questa variante non è stata trovata nei 250 controlli analizzati e non è presente nel fratello non affetto.

Figura 7.8: cromatogramma della sequenza dell’esone 26 di CADPS2 nella famiglia con un figlio

affetto da ritardo mentale. La madre (8204) trasmette la mutazione (T  G) al figlio (5061) affetto ma non al fratello non affetto .

Quindi, sebbene tutte le varianti trovate sono state ereditate da un genitore, nessuna di queste varianti è descritta in dbSNP o nel database 1000 genomi, e, ad eccezione di una sola variante, tutte sono assenti in 250 controlli italiani. Inoltre, tramite PolyPhen,

139 uno strumento di predizione bioinformatica abbiamo analizzato l’ipotetico effetto funzionale di queste varianti: solo una variante, la M630T nell’esone 13 di CADPS2 è stata predetta avere un effetto “dannoso” sulla funzione della proteina da PolyPhen.