Validazione dei CNV tramite Real Time

La PCR Real Time è in grado di amplificare e quantificare il DNA in maniera simultanea. La quantificazione viene effettuata determinando un segnale di fluorescenza generato in seguito al legame di un reagente al prodotto amplificato nei primi stadi della reazione di PCR. Uno dei coloranti fluorescenti maggiormente utilizzati è il SYBR GREEN in grado di legarsi al solco minore del DNA. Ad ogni ciclo di amplificazione la fluorescenza emessa dal SYBR GREEN intercalato alla doppia elica è direttamente proporzionale al numero di copie prodotte dalla reazione, per cui, registrando la quantità di emissione fluorescente per ogni ciclo, è possibile monitorare la reazione di polimerizzazione durante la sua fase esponenziale, nella quale il primo incremento significativo di prodotti neo-sintetizzati è collegato alla concentrazione iniziale di stampo nel campione. Infatti, maggiore è il numero di copie iniziali dell’acido nucleico, prima si osserverà un incremento significativo della fluorescenza (figura5.3). Tuttavia il legame del SYBR GREEN non è altamente specifico perché può legarsi ai dimeri di primers o anche ai prodotti non specifici di amplificazione.

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Figura 5.4: processo di reazione del colorante SYBR GREEN.

Un metodo di detection più specifico, ma tuttavia più costoso rispetto a quello basato sul SYBR GREEN, consiste nell’uso di sonde gene-specifiche (sonde TaqMan) che si appaiano nella zona compresa fra i due primers (forward e reverse) e contenenti un colorante fluorescente (Reporter), solitamente di colore verde, all’estremità 5’ ed un colorante spegnitore (Quencher), di colore rosso, all'estremità 3’. Durante la fase di annealing della sonda al DNA stampo, grazie alla vicinanza del colorante ad alta energia in 5’ e quello a bassa energia in 3’, si verifica un trasferimento di energia fluorescente (FRET) dal primo al secondo annullando così l‟emissione del segnale di fluorescenza; durante, invece, la fase di replicazione, la DNA-polimerasi sfrutta la propria attività esonucleasica 5’→ 3’ per degradare la sonda correttamente appaiata; come conseguenza, l’allontanamento tra il reporter ed il quencher pone fine all’attività di assorbimento di quest’ultimo e fa in modo che il reporter inizi ad emettere fluorescenza. Quest’ultima incrementerà ad ogni ciclo in modo proporzionale al tasso di degradazione della sonda. L’accumularsi del prodotto amplificato viene rivelato monitorando quindi l‟incremento di fluorescenza del reporter (figura xxx).

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Figura 5.5: processo di reazione delle sonde TaqMan.

Dato l’utilizzo del SYBR GREEN come metodo di detection, prima di effettuare l’esperimento vero e proprio, è necessario allestire una curva standard di calibrazione. Si sfrutta il metodo della quantificazione assoluta che prevede l’utilizzo di un DNA genomico di controllo (reference), non contenente il CNV di interesse, a concentrazione nota, in triplicato, e diluizioni progressive (20 ng/μl; 10 ng/μl; 5 ng/μl; 2,5 ng/μl). L’analisi è stata eseguita sullo strumento 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). Ogni run consiste di una singola piastra da 96 pozzetti. La miscela di reazione contiene 1 μl di ciascun primer (forward e reverse) ad una concentrazione di 10 μM; 10 μl di SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) contenente SYBR Green I Dye, AmpliTaq Gold DNA Polymerase, dNTPs e buffer; si arriva ad un volume finale di 15 μl con acqua e si aggiungono 5 μl di DNA. Per il disegno dei primers è stato utilizzato il programma Primer 3. Insieme ai primers specifici per i frammenti di interesse è stata utilizzata una coppia di primers che permette l‟amplificazione di un gene di controllo (FOXP2).

Le condizioni di amplificazione per la costruzione della curva standard prevedono tre stadi:

1) Enzyme Activation: 20 sec a 95°C. 2) Melting: 3 sec a 95°C; 30 sec a 60°C.

3) Annealing/Extension: 15 sec a 95°C; 1 min a 60°C, per 40 cicli.

A questi 3 stadi viene aggiunto una stadio di lenta dissociazione che permette di evidenziare l’eventuale

86 appaiano nella zona compresa fra i due primers (forward e reverse) e contenenti un colorante fluorescente (Reporter), solitamente di colore verde, all’estremità 5’ ed un colorante spegnitore (Quencher), di colore rosso, all'estremità 3’. Durante la fase di annealing della sonda al DNA stampo, grazie alla vicinanza del colorante ad alta energia in 5’ e quello a bassa energia in 3’, si verifica un trasferimento di energia fluorescente (FRET) dal primo al secondo annullando così l’emissione del segnale di fluorescenza; durante, invece, la fase di replicazione, la DNA-polimerasi sfrutta la propria attività esonucleasica 5’→ 3’ per degradare la sonda correttamente appaiata; come conseguenza, l’allontanamento tra il reporter ed il quencher pone fine all’attività di assorbimento di quest’ultimo e fa in modo che il reporter inizi ad emettere fluorescenza. Quest’ultima incrementerà ad ogni ciclo in modo proporzionale al tasso di degradazione della sonda. L’accumularsi del prodotto amplificato viene rivelato monitorando quindi l’incremento di fluorescenza del reporter (figura 5.4).Dato l’utilizzo del SYBR GREEN come metodo di detection, prima di effettuare l‟esperimento vero e proprio, è necessario allestire una curva standard di calibrazione. Si sfrutta il metodo della quantificazione assoluta che prevede l’utilizzo di un DNA genomico di controllo (reference), non contenente il CNV di interesse, a concentrazione nota, in triplicato, e diluizioni progressive (20 ng/μl; 10 ng/μl; 5 ng/μl; 2,5 ng/μl). L’analisi è stata eseguita sullo strumento 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). Ogni run consiste di una singola piastra da 96 pozzetti. La miscela di reazione contiene 1 μl di ciascun primer (forward e reverse) ad una concentrazione di 10 μM; 10 μl di SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) contenente SYBR Green I Dye, AmpliTaq Gold DNA Polymerase, dNTPs e buffer; si arriva ad un volume finale di 15 μl con acqua e si aggiungono 5 μl di DNA. Per il disegno dei primers è stato utilizzato il programma Primer 3. Insieme ai primers specifici per i frammenti di interesse è stata utilizzata una coppia di primers che permette l‟amplificazione di un gene di controllo (FOXP2).

Le condizioni di amplificazione per la costruzione della curva standard prevedono tre stadi: 1) Enzyme Activation: 20 sec a 95°C.

2) Melting: 3 sec a 95°C; 30 sec a 60°C.

3) Annealing/Extension: 15 sec a 95°C; 1 min a 60°C, per 40 cicli.

A questi 3 stadi viene aggiunto una stadio di lenta dissociazione che permette di evidenziare l’eventuale presenza di dimeri di primers:

4) Dissociation: 15 sec a 95°C; 15 sec a 60°C.

Il risultato è in forma di un grafico con andamento sigmoidale che mostra il numero di cicli di PCR in funzione dell’incremento di fluorescenza (Rn), detto amplification plot (figura 5.5).

87 •Baseline: numero iniziale di cicli di PCR in cui c’è un piccolo cambiamento nel segnale di fluorescenza.

•Fase esponenziale: aumento significativo di fluorescenza in seguito alla reazione di amplificazione.

•Fase di plateau: fase in cui non si osserva più un incremento nei prodotti; corrisponde alla resa effettiva.

•Threshold: linea la cui intersezione con l’amplification plot definisce il Ct.

Figura 5.6: amplification plot.

Il ciclo della PCR (ciclo soglia, Ct), specifico per ogni campione, identifica il valore del ciclo di PCR in cui la curva in fase esponenziale interseca la linea soglia, ossia il ciclo in cui viene raggiunto il valore soglia di fluorescenza. Il numero dei cicli necessari perché un campione raggiunga il suo Ct è inversamente proporzionale al numero di copie target presenti inizialmente. Il grafico che mostra i valori di Ct, misurati per campioni a concentrazione nota, in funzione del Log della concentrazione iniziale del target definisce la curva standard (figura 5.6). La pendenza della curva standard (slope) permette di determinare l’efficienza della reazione di amplificazione. Lo strumento fornisce inoltre la curva di dissociazione (figura5.7), un grafico che mostra il cambiamento di fluorescenza, dovuto all’interazione della sonda con il DNA a doppio filamento, in funzione della temperatura di melting (Tm), in corrispondenza della quale il 50% del DNA è a singolo filamento (figura 3). Durante la fase di denaturazione del DNA, quando viene raggiunta la temperatura di melting, si assiste ad un improvviso decremento della fluorescenza, dovuto alla dissociazione dei filamenti di DNA e al rilascio della sonda. In questo modo è possibile identificare i prodotti di amplificazione non specifici, come la formazione di dimeri di primer. Il prodotto specifico è mostrato con una temperatura di melting più alta rispetto al dimero di primer.

Per l’esperimento vero e proprio si prepara la stessa miscela di reazione usata per la curva standard, ma utilizzando il DNA dei campioni di interesse (in questo caso dell’individuo affetto da autismo,

88 dei genitori e di eventuali fratelli affetti e non) e il DNA di controllo a concentrazione nota (5 ng/μl). Allo stesso modo ogni frammento è amplificato in triplicato.

Il programma prevede due stadi e manca dello stadio di dissociazione: 1) Enzyme Activation: 20 sec a 95°C.

2) Melting: 3 sec a 95°C; 30 sec a 60°C, per 40 cicli.

Per ogni campione e per ogni sonda, si ottiene un diverso valore di Ct. Il DNA dei campioni di interesse è normalizzato sul DNA di controllo tramite il calcolo del Delta Ct (Ctreference - Ctcampione). Altri due parametri calcolati sono il Ratio (Esonda(delta Ct) / EFOXP2 (delta Ct) ), per normalizzare ogni sonda testata sul gene di controllo FOXP2, e il Copy number (2*Ratio) da cui è possibile valutare, rispetto al numero di copie di FOXP2 (valore di copy number intorno al 2), se un frammento del gene di interesse, amplificato con lo specifico primer, risulta essere deleto (valore di numero di copie compreso tra 0.7 e 1.3) o duplicato (valore di numero di copie compreso tra 2.7 e 3.3).