È da sottolineare, comunque, come negli unici 3 pazienti risultati realmente positivi per le IgE al WB, p4 abbia sempre valori >100 (pz.2,17 e 18).
Tutti i pazienti che presentano valori elevati all’immunoCAP ( p4 > 3,5 KUA/L) (N Abattouy et al. ; 2012) mostrano poi un’intensa reattività al WB diverse bande di antigeni considerate aspecifiche. In queste situazioni, la grande quantità di IgE anti-Anisakis rilevate all’iCAP potrebbe derivare sia da uno stato atopico del soggetto (in questo caso dovremo aspettarci un’elevata conta eosinofilica) o dalla cross-reattività intrinseca delle IgE rivolte verso antigeni somatici di Anisakis, in
particolare verso Ani s 3, antigene somatico che corrisponde alla tropomiosina (banda 37-41 kDa).
Nel caso 1, per esempio, abbiamo una positività elevata all’immunoCAP (p4> 39,7 KUA/L) e un’intensa attivazione di bande aspecifiche al WB (IgG). La banda da 37-41 kDa risulta ben delineata, mentre l’attivazione della banda da 24kDa è dubbia. A questo proposito, bisogna ricordare come alcuni autori posizionino la banda relativa ad Ani s 1 sui 21-24kDa (Audicana e Kennedy 2008). L’eosinofilia del paziente era nella norma, permettendo dunque di escludere l’atopia come il fattore causale delle molte bande attivate. Sono quindi state effettuate le IgE specifiche, che però sono risultate negative. Questi dati fanno interpretare sia l’elevato valore di iCAP sia l’attivazione aspecifica delle IgG al WB come dovute ad una cross-reattività sviluppatasi contro panallergeni.
Fig. 15
Fig. 16
Fig 15: WB (IgG) pz n°1. Possiamo vedere l’attivazione di molte bande
aspecifiche. Tra i 37 e i 50 kDa abbiamo la presenza di bande molto demarcate, così come al livello della zona dei 20kDa. Se effettivamente Ani s 1 può collocarsi a 21kDa, il WB dovrebbe considerarsi positivo.Fig 16: WB(IgE) pz n°1.
Possiamo osservare come non ci sia alcuna attivazione né della banda da 24kDa, né di tutte le altre bande che si osservano alle IgG, ma soltanto un’attivazione leggera delle bande attorno a 50kD.
Nel caso 13, invece, possiamo vedere come a un valore elevato all’immunoCAP ( p4>6,09 KUA/L) non corrisponde una positività al WB né per quanto riguarda le IgG (fig. 17) né per quanto riguarda le IgE (fig. 18). In questo paziente, ricoverato per un empiema della colecisti, era stata messa in evidenza all’imaging la presenza di un nematode, e per questo era stato formulato il sospetto eziologico di anisakidosi atipica. La mancata attivazione della banda da 24kDa al WB (IgG) ci permette di escludere con certezza la diagnosi di anisakidosi, e di evitare l’esecuzione delle IgE, mentre l’intensa attivazione di bande aspecifiche, compresa la banda 37-41kDa, permette di formulare l’ipotesi che il nematode in questione fosse un Ascaride. (fig 18) Anche in questo caso, l’eosinofilia era nella norma.
Fig. 17 Fig. 18 Fig. 19
Per quanto riguarda il caso 10, ovvero uno dei quattro pazienti risultati negativi all’immunoCAP (p4=0,01) , abbiamo di nuovo un’intensa attivazione di bande aspecifiche al WB (IgG), compresa la banda da 37kDa, a fronte della mancata attivazione della banda da 24kDa. In questo caso però il paziente presentava anche una condizione di ipereosinofilia plasmatica, ed è quindi plausibile che l’attivazione aspecifica sia conseguenza di uno stato atopico, dove le numerose IgE del soggetto vanno a legarsi ai panallergeni, senza però reagire con Ani s 1. (fig. 19).
Sempre parlando dei casi risultati negativi all’iCAP è da sottolineare come in uno di questi, il caso 9, fosse stata effettivamente ritrovata la larva alla colonscopia, effettuata per dei disturbi intestinali non meglio
specificati. Ad un valore di IgE anti-p4 di 0,02 corrisponde la mancata attivazione della banda da 24kDa al WB (IgE). E’ interessante, però, il fatto che il WB per le IgG possa considerarsi positivo, e insieme all’attivazione della banda 24 mostri anche un’intensissima attivazione della banda 37 kDa. (Figxxx) In questo caso, dunque, sappiamo con certezza che il contatto con la larva c’è stato e il soggetto si è presumibilmente sensibilizzato. La negatività delle IgE sia all’iCAP che al WB può essere dovuta o ad un tempo eccessivo che si è lasciato trascorrere tra l’esordio dei sintomi e il prelievo, o al fatto che il paziente non ha realmente sviluppato allergia ad Anisakis.
Nel caso 15, invece, l’ultimo dei 4 casi negativi (Tab. 7) , dove la richiesta del dosaggio delle Ig specifiche anti-Anisakis è stata fatta in seguito ad una sintomatologia di tipo gastrointestinale, abbiamo un p4 di 0,07 KUA/L associato ad un WB(IgG) completamente negativo. In fig. 20 si può vedere come non si sia verificata alcuna attivazione, neanche delle bande aspecifiche, portando ad escludere non solo un’infezione da parte di Anisakis, ma anche un’eziologia parassitaria o allergica dei sintomi. In seguito, infatti, è stata fatta la diagnosi di infezione da
Fig. 20
Il caso 6 ha effettuato il test dell’ iCAP in seguito a sintomi di tipo allergico, e a fronte di un valore di p4 di 8,27 kDa, sono state ricercate al WB le IgG, risultando positive. (Fig. 21) In questo paziente erano state testate anche le IgE contro altri allergeni cross-reattivi, come astice, aragosta, granchio, gambero, arachide e merluzzo, risultando tutte negative. Questo era un dato che poteva rafforzare il sospetto di allergia ad Anisakis, anche considerando il fatto che la banda 37-41kDa, benchè positiva, non risultasse particolarmente demarcate. In seguito, però, la ricerca delle IgE ha dato risultati negativi (Fig. 22) , indicando che
Anisakis non è il responsabile della sintomatologia e dell’elevato valore
di p4 all’iCAP . L’eziologia è dunque da ricercare nei rimanenti allergeni che danno cross-reattività con Anisakis. Si ricorda , a questo proposito, come anche Ani s 2, che corrisponde ad una paramiosina e ha un peso
specifico di 97kDa, sia stato indicato come possibile responsabile di cross-reattività antigenica. (Guarneri et al. 2006)
Nel WB sulle IgE, però, la banda da 37kDa appare effettivamente marcata (Fig 22) . Ciò spingerebbe ad allargare la ricerca della positività ad altri antigeni indagando in primo luogo Ascaris e altri come Toxocara e Dermatophagoide.
Fig. 21 Fig. 22
Il caso 5, invece, ha presentato sintomi di natura gastrointestinale a fronte di una negatività alla coprocoltura per diversi batteri (Salmonella
spp, Shigella spp, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejunii, Escherichia coli 0157 enteropatogena, Candida spp) ed esame
parassitologico delle feci negativo. Anche le IgA antitransglutaminasi sono risultate negative, escludendo la celiachia come causa delle manifestazioni cliniche. Le IgE specifiche sono risultate discretamente
positive all’immunoCAP (3,28) e anche il WB ha confermato la positività delle IgG (banda 24). A fronte di una debole attivazione della banda 37, però, abbiamo un’intensa attivazione di molte altre bande aspecifiche che indica, presumibilmente, una sottostante atopia (fig 23). La ricerca di IgE specifiche con WB è risultata negativa (fig. 24), quindi nonostante il soggetto sia entrato in contatto con il parassita, o è passato molto tempo tra sintomatologia e prelievo (più di un mese), oppure non siamo di fronte ad un caso di anisakidosi.
Fig. 23 Fig. 24
Abbiamo già accennato come in alcuni dei pazienti esaminati, 7 in totale, il valore immunoCAP di p4 è risultato particolarmente elevato, ovvero > 100 (casi 16, 17, 18, 19, 20, 21) e > 200 nel caso 2. Non è detto, però, che a un valore così elevato di p4 equivalga necessariamente una positività al WB.
Infatti, possiamo vedere che nei casi 19, 20 e 21 ( p4 > 100) il WB è risultato negativo per la presenza di IgE specifiche nonostante il fatto che la larva è stata evidenziata e rimossa endoscopicamente dal lume gastrico. Questi pazienti avevano sviluppato i sintomi tipici dell’anisakidosi gastrica (dolore epigastrico, dispepsia e vomito) tra le 24 ore e i 2 giorni dal consumo di pesce crudo fresco (acciughe marinate), e la larva, una volta rimossa, è stata sequenziata rivelandosi appartenente alla classe di A.Pregreffi.
In questo caso, quindi, si ha la certezza che la larva vitale Anisakis abbia almeno in parte penetrato la parete, provocando la sintomatologia; la mancanza della banda da 24kDa, però, indica che nonostante il contatto sia innegabilmente avvenuto, i soggetti non si sono sensibilizzati ad Ani s 1; lo conferma il fatto che la sintomatologia mancava completamente della componente allergica.
Fig. 25
Invece, nel caso dei pazienti 17 e 18, il quadro clinico corrispondeva in toto a quello della GAA, con dolore epigastrico e manifestazioni allergiche, in particolare edema della mucosa orale e periorbitale nel caso 17 ed intensa orticaria nel caso 18). I sintomi sono comparsi a due giorni di distanza (caso 17) e a 24ore (caso 18) dal consumo di acciughe marinate.Le IgE specifiche sono risultate positive sia all’iCAP che al WB. Anche in questi casi la larva è stata evidenziata, estratta e sequenziata molecolarmente, risultando sempre appartenente alla specie
A.pregreffi.
Possiamo vedere in figura 25 la franca attivazione della banda da 24kDa, e , specialmente nel nel caso 17, la presenza di un’intensa banda tra i 100 e i 150 kDa, che potrebbe corrispondere alla banda 139 (Ani s 7 ) che
recentemente è stata indicata come un secondo indicatore specifico dell’infezione ad Anisakis (Daschner, unpublished data, 2013).
Altri due pazienti sono risultati francamente positivi all’immunoCAP, ovvero il caso 2 e il caso 16, con valori di p4 rispettivamente di 200 KUA/L e 100 KUA/L. Ad un’esecuzione iniziale del WB per le IgG, il risultato era, in entrambe i casi, dubbio (nel caso 2 non si era avuta addirittura nessuna attivazione di banda).
Valori elevati di p4, nel caso non ci sia sicurezza sulla corretta costituzione delle strisce od esecuzione della procedura dovrebbero orientare ad una ripetizione del WB nel caso i risultati siano discordanti. Nei casi 1,2,3 e 16, per esempio, a fronte dell’elevato p4 (39,7/ >200 / 29,5 / > 100 KUA/L) con un WB negativo, il test è stato ripetuto ed effettivamente la seconda prova ha dato risultati positivi sia per quanto riguarda le IgG, sia per quanto riguarda le IgE nel caso 2 (fig. 26). Per quanto riguarda il caso 16, è stata fatta in seguito diagnosi di positività per la filaria, e indice che l’elevato valore di immunoCAP che si accompagna al WB per le IgE negativo (fig. 27) è dovuto a fenomeni di cross-reattività anticorpale.
Fig. 26 Fig. 27
8. CONCLUSIONI
La determinazione dello stato di sensibilizzazione ad Anisakis è importante non solo per identificare e risolvere un’eventuale sintomatologia acuta o cronica, ma soprattutto per selezionare quei pazienti che, in un futuro contatto con il parassita , potrebbero sviluppare sintomi allergici più o meno importanti.
La diagnosi di sensibilizzazione necessita dell’integrazione di dati clinici e strumentali; una sintomatologia specifica correlata ad un’anamnesi fortemente indicativa (sintomi che si presentano in relazione al consumo di pesce) permette di interpretare meglio un dato strumentale soggetto ad elevata prevalenza di falsi positivi per quanto riguarda l’immunoCAP, e di occasionali falsi negativi per quanto riguarda il Western Blot.
Lo studio supporta il fatto che quando i valori di immunoCAP sono bassi (in particolare con p4 < 0,35 KUA/L ) , anche se considerati ancora positivi al test Phadia, sono probabilmente dei falsi positivi, e infatti risultano negativi al WB per le IgE. (tab. 3)
Rimane comunque possibile che a valori elevati di p4 non corrisponda uno stato di sensibilizzazione verso il parassita, e questo è vero anche nei casi in cui ci sia stato l’effettivo contatto con la larva (19,20,21). Non sempre, infatti, il contatto con Anisakis induce sensibilizzazione; vari fattori svolgono un ruolo evidentemente importante nella manifestazione di GAA, tra cui l’effettivo livello di penetrazione nella parete gastrointestinale e la predisposizione individuale, con sottostanti stati atopici o la presenza di varianti alleliche per l’ipersensibilizzazione da Anisakis presente nel gene HLA di classe II. (Sanchez-velasco et al. 2000).
In questi pazienti, dunque, la larva potrebbe non essere riuscita a penetrare la mucosa, magari perché poco vitale, oppure essere stata eliminata senza sviluppo di una risposta immune contro Ani s 1. L’elevato valore immunoCAP sarebbe in questo caso un indice della risposta agli antigeni somatici, ma non rifletterebbe uno stato allergico. In generale, comunque, quando la reattività verso p4 è molto elevata ( > 100 ), sia questo dovuto ad una vera sensibilizzazione ad Anisakis, ad un
solo contatto con la larva , o ad uno stato atopico con cross-reazioni, sembra più probabile che i pazienti mostrino una sintomatologia specifica (gastrica o gastroallergica).
Valori elevati all’immunoCAP corrispondono però anche ad un maggiore riconoscimento aspecifico di antigeni, tra cui quello di 37kDa. In questi casi testare i sieri contro Ascaris e altri panallergeni è utile per orientarsi nella diagnosi, escludendo o confermando la presenza di cross.reazioni. Anche misurare l’eosinofilia plasmatica può dare indicazioni sullo stato di atopia del soggetto, permettendo un migliore inquadramento del valore IgE anti-p4.
Questo è particolarmente importante se si considera che un’intensa risposta all’immunoCAP, insieme alla positività al WB, dispone a selezionare il paziente come ‘’a rischio’’ per lo sviluppo di sintomi allergici qualora dovesse venire in contatto nuovamente con Anisakis. Anche un WB negativo per le IgE, ma positivo per le IgG (24kDa) ed associato ad un iCAP con p4 elevato deve orientare ad identificare un certo grado di rischio per il paziente. Infatti, le IgG positive indicano che il contatto con Anisakis in passato è avvenuto, e il soggetto si è sensibilizzato. Anche se presumibilmente, al momento del prelievo, i sintomi non erano correlati ad Anisakis, l’elevato p4 da informazioni sull’intensa reattività del paziente ad allergeni cross-reattivi; per questo,
in caso di un successivo incontro con la larva, posso aspettarmi che questo paziente sviluppi sintomi allergici.
Potrebbe poi essere ipotizzato, alla luce del fatto che ad elevati valori di iCAP (>3,5 KUA/L) si riscontra una positività delle IgG al WB del tot%, che sia proprio il contatto precedente con Anisakis (magari associato ad una suscettibilità individuale) il responsabile della sensibilizazione e quindi dell'elevata reattività verso i panallergeni, che poi viene interpretata dall'immunCAP come ''anti-Anisakis''.
D’altro canto, un WB positivo per le IgG ma negativo per le IgE ed associato ad un immunoCAP con bassi valori di p4, nel caso il prelievo sia stato fatto a distanza dalla presentazione dei sintomi, può orientare verso l’ipotesi che il contatto con Anisakis sia effettivamente stato il responsabile delle manifestazioni cliniche. Il basso valore iCAP infatti fa pensare che il paziente non sia un paziente atopico o sensibilizzato verso panallergeni cross-reattivi.
Da questi dati e dalla loro analisi si capisce come la diagnosi di sensibilizzazione, così come l’identificazione di pazienti a rischio di allergia ad Anisakis, non si possa ricavare con facilità e sicurezza attraverso il semplice dato di laboratorio.
Come spesso accade in medicina, l’anamnesi, le evidenze cliniche, e le indagini strumentali devono essere attentamente comparate per arrivare alla diagnosi.
Nel nostro caso, per una corretta interpretazione del dato di laboratorio bisogna tra l'altro porre attenzione al momento in cui viene effettuato il prelievo rispetto alla presentazione dei sintomi, che deve essere abbastanza tempestivo per rilevare un titolo anticorpale significativo. Anche il confronto tra i dati dell’iCAP e del WB deve essere fatto su sieri prelevati in doppio, per non falsare i risultati.
Alla luce dei risultati ottenuti, l'immunoCAP, a causa della scarsa specificità dimostrata, sembra non essere una metodica attendibile per la diagnosi di sensibilizzazione ad Anisakis, ma si dimostra molto più sensibile nel rilevare l'avvenuto contatto con la larva.
Inoltre, grazie al suo dato quantitativo, fornisce un ausilio importante nell'identificare quei pazienti ''a rischio'' perchè intensamente reattivi agli stimoli antigenici di Anisakis e degli antigeni cross-reattivi.
Per queste sue caratteristiche, potrebbe essere indicata come metodica di screening iniziale, ma rimarrebbe al Western Blot il compito di individuare i veri positivi.
D'altro canto, rimane da verificare l'effettiva sensibilità del WB, cercando di aumentarla attraverso metodi per amplificarne il segnale;
l'elevata discordanza tra la positività all'iCAP e al WB, fino ad ora attribuita ad una scarsa specificità dell'iCAP, potrebbe anche essere dovuta ad un deficit di rilevamento del WB di bassi, seppur presenti, livelli di IgE specifiche.
Al di la di questo, la positività al WB delle IgE anti Ani s 1 rimane il dato che indica con sicurezza la presenza di sensibilizzazione, rendendo la metodica essenziale per la diagnosi di certezza.
Le altre informazioni qualitative ricavabili dal WB (IgG, presenza di bande aspecifiche), associate al risultato di iCAP, ad eventuali altri test per indagare la positività delle IgE verso antigeni cross-reattivi (in particolare verso gli Ascaridi, e tra loro Toxocara), all'eosinofilia plasmatica e, soprattutto, all'anamnesi e alla clinica, permettono poi di inquadrare in modo migliore tutti quei pazienti per cui la diagnosi rimane dubbia.
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